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乙酰化是一种重要的、可逆的蛋白质翻译后修饰。乙酰化修饰可通过改变蛋白质功能调节基因表达,越来越多物种中乙酰化被大量鉴定。家蚕,属鳞翅目泌丝昆虫,是以桑叶为食料的吐丝结茧的经济昆虫之一,具有十分丰富的价值。前期研究中,通过nano-HPLC/MS/MS分析了家蚕的乙酰化组。鉴定发现,家蚕体内卵黄蛋白、载脂蛋白含有大量乙酰化修饰位点,这两类蛋白构成了家蚕脂肪体组织。鉴定结果中还发现,家蚕血淋巴储藏类蛋白家族中SP3蛋白（BmSP3）也存在高度乙酰化。本研究主要鉴定了BmSP3蛋白的乙酰化修饰,证实乙酰化修饰可提高细胞内BmSP3蛋白的稳定性。这为乙酰化修饰广泛的参与调控家蚕体内营养贮存与利用提供新的功能依据。首先开展BmSP3蛋白乙酰化修饰鉴定,进行了BmSP3蛋白的生物学信息分析,包括BmSP3蛋白氨基酸组分、跨膜性、疏水性、二级结构及其高级结构。然后根据基因库中编码BmSP3蛋白的基因序列（Gen Bank登录号:JQ043182）,设计其上下游引物,PCR扩增BmSP3基因ORF片段,使用了BmN细胞的总RNA逆转录形成的c DNA作为扩增模板,再将PCR产物与真核瞬时表达载体pIEx-1-GFP连接,成功构建了重组载体pIEx-1-GFP-His-SP3,转染家蚕BmN细胞,过表达BmSP3蛋白,WB检测到BmSP3蛋白在真核细胞中表达良好;同时,使用6x His抗体免疫共沉淀融合蛋白His-SP3蛋白,应用乙酰化抗体WB检测表明,BmSP3蛋白存在乙酰化。随后研究了乙酰化修饰对BmSP3蛋白的表达影响。BmN细胞过表达BmSP3蛋白,使用去乙酰转移酶抑制剂Cocktail处理细胞,上调胞内的乙酰化水平,结果导致BmSP3蛋白的表达显著增加;乙酰转移酶抑制剂A485和C646处理细胞后下调胞内乙酰化水平,BmSP3蛋白的表达量随乙酰化水平下调而下调。进一步免疫共沉淀获得His-SP3蛋白,乙酰化抗体WB检测结果发现,Cocktail处理细胞明显上调了胞内His-SP3蛋白的乙酰化水平。这表明BmSP3乙酰化水平与其蛋白表达呈正相关。使用Cocktail、A485和C646处理过表达BmSP3蛋白的家蚕细胞,分别上调或下调胞内蛋白的乙酰化水平,RT-q PCR检测发现BmSP3基因的m RNA水平无显著变化,这表明BmSP3蛋白的乙酰化修饰在转录后水平上调控其蛋白的表达。接下来开展了乙酰化修饰对BmSP3蛋白稳定性的影响的研究。BmN细胞过表达BmSP3蛋白后,使用Cocktail处理细胞增加BmSP3蛋白的乙酰化水平,然后分别用蛋白合成抑制剂CHX和蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,检测BmSP3蛋白表达水平。结果表明,CHX处理细胞阻断了蛋白合成途径后,与对照组相比,Cocktail处理使得BmSP3蛋白的降解趋势幅度平缓,且有上升趋势;同时MG132处理细胞阻断蛋白酶体降解途径后,与对照组相比,Cocktail处理细胞可导致BmSP3蛋白表达的上升趋势更显著,这表明BmSP3蛋白的乙酰化修饰提高了BmSP3蛋白的稳定性,且与蛋白酶体的降解途径相关。最后开展了家蚕乙酰转移酶CBP（BmCBP）蛋白催化BmSP3的乙酰化研究。根据编码家蚕BmCBP蛋白的基因序列（Gen Bank号:XM＿038015130）,成功合成了BmCBP基因的dsRNA。RNAi方法干扰BmCBP蛋白表达后,发现组蛋白H3的蛋白水平无变化,而组蛋白H3赖氨酸27（H3K27）位点的乙酰化水平显著降低,这表明BmCBP-dsRNA可通过RNA干扰敲低BmCBP蛋白表达,从而降低BmCBP已知底物组蛋白H3K27的乙酰化水平。将BmCBP-dsRNA和重组质粒pIEx-1-GFP-His-SP3共转染BmN细胞,免疫共沉淀融合蛋白His-SP3,乙酰化抗体WB检测发现,随着BmCBP蛋白的敲低,BmSP3蛋白的乙酰化水平也下调,同时发现其泛素化水也显著提升。这表明乙酰转移酶BmCBP可催化BmSP3蛋白的乙酰化修饰,同时乙酰化修饰和其泛素化修饰存在竞争。进一步采用BmCBPdsRNA下调胞内BmCBP的表达,同时采用BmCBP蛋白小分子抑制剂A485处理BmN细胞抑制其乙酰转移酶活,WB检测表明,两者都可以导致胞内BmSP3蛋白的表达下调。综上所述,家蚕乙酰转移酶BmCBP可以催化BmSP3蛋白的乙酰化修饰,通过催化乙酰化修饰在翻译后水平上调BmSP3蛋白的表达,增强其蛋白的稳定性;同时BmCPB催化的BmSP3蛋白乙酰化可以竞争性抑制其泛素化,因此,BmCPB催化的乙酰化修饰可能通过抑制泛素介导的蛋白酶体降解途径来提高BmSP3蛋白的稳定性和胞内的累积。