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乙型脑炎(JE)是由乙型脑炎病毒(JEV)引起的一种人畜共患虫媒性传染病。猪是该病毒在自然界最重要的贮存和增殖宿主,免疫接种疫苗是有效防制该病传播的重要方法。DNA疫苗是近年来JE预防的重要研究方向。本研究所构建的DNA疫苗以JEV的prM△E(prM基因以及编码E蛋白的N端的398个氨基酸序列的基因,即prM-E基因去掉E基因的膜锚定蛋白序列)为靶基因,融入了组织纤溶酶原激活物(TPA)的分泌型信号序列(signal sequence derived from tissue plasminogen activator)修饰目的基因prMAE,本研究还对此JEV DNA疫苗的免疫原性进行了研究,主要研究内容如下：1. PVAX-prMAE和PVAX-TPA-prMAE真核表达质粒的构建采用RT-PCR扩增SA14-14-2株prM△E基因,将其插入pMD19-T载体,构建重组质粒19T-PrM△E。对19T-prM△E的核苷酸序列测定与分析表明：克隆的prM△E基因长度为1695 bp,可编码565个氨基酸残基。采用重叠PCR的方法扩增TPA信号肽序列,设计并合成两条互补的引物进行扩增,将其插入pMD19-T载体,构建重组质粒19T-TPA。对19T-TPA的核苷酸序列测定与分析表明：克隆的TPA信号肽序列全长69 bp,可编码23个氨基酸残基。研究以PVAX1为载体,构建了真核表达质粒PVAX-prM△E和PVAX-TPA-prM△E。对所构建质粒进行酶切、PCR和测序鉴定正确后,以脂质体转染法将构建的PVAX-TPA-prM△E和PVAX-prM△E真核表达质粒分别转染COS-7细胞,并以间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达。结果显示,转染的COS-7细胞呈现特异性荧光。表明上述构建的两种重组质粒可在体外正确表达,且表达的蛋白具有良好的免疫反应原性,PVAX-TPA-prM△E的蛋白表达量要明显大于PVAX-prM△E,说明TPA信号肽序列有效促进了目的蛋白的分泌表达。PVAX-TPA-prM△E和PVAX-prM△E表达载体的成功构建为JEV DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。2.DNA疫苗(PVAX-TPA-prM△E)的免疫原性研究分别将DNA疫苗PVAX-TPA-prM△E、PVAX-prM△E通过腿部肌肉注射6周龄昆明小鼠,间隔两周加强免疫一次,共免疫3次。分别在首疫后的14、35与42d通过间接ELISA测定免疫小鼠血清特异性JEV IgG抗体水平。结果表明：各免疫组均可有效诱导特异性JEV血清IgG抗体的产生,显示了JEV DNA疫苗良好的免疫原性。同时,PVAX-TPA-prMAE免疫组抗体水平在整个免疫过程中高于PVAX-prMAE免疫组,在免疫后42天差异极显著(P<0.01)。MTT法检测免疫小鼠脾T淋巴细胞增殖情况,结果显示,PVAX-TPA-prMAE组小鼠特异性T淋巴细胞增殖SI值大大提高,出现可明显促进特异性淋巴细胞的增殖。因此将TPA信号肽序列融入质粒中是提高DNA疫苗免疫活性的有效途径。对三次加强免疫后的小鼠进行野毒株CZ-1脑内攻毒保护试验，观察小鼠的精神状态,记录小鼠的死亡情况,结果表明：PVAX-TPA-prMAE和PVAX-prMAE对小鼠均有较强的保护作用,分别为70%和50%,说明PVAX-TPA-prMAE疫苗比PVAX-prMAE疫苗对小鼠有更好的保护效果。