CBX7(Chromobox Homolog 7)是CBX家族蛋白成员之一，也是PRC1(Polycomb repressive complex 1，PRC1)的一个组成部分，它在细胞寿命延长和癌症发生中起着重要的调控作用。CBX7是多梳谱系蛋白中研究得最为广泛的代表[1]，由于它参与多种肿瘤抑制因子沉默机制，并与不同类型恶性肿瘤的发生密切相关，被认为是一个有趣的潜在药物靶点。相关研究表明[2-4]CBX7是延长细胞寿命、延缓衰老、促进增殖和赋予成体和胚胎干细胞全能性的主控制器。同时[5]，CBX7在一些血液恶性肿瘤中也起着核心作用：它启动和加速淋巴管生成，并与Myc合作产生侵袭性淋巴瘤。CBX7在小鼠造血干细胞中的过表达能够促进T细胞白血病的增殖和发生[6](而其近亲CBX8则没有)。更重要的是，多份报道[4,6,7]表明CBX7的增殖/促存活功能与其结合H3K27Me3的能力密切相关；当一个单独的Kme 3结合残基在其染色质域发生突变时，CBX7所促进的增殖效果就会消失。然而，CBX7在癌症发展中的作用仍然存在争议[8-14]：对于不同的细胞环境和癌症类型， CBX7可作为致癌基因也可成为肿瘤抑制因子。据报道[14]将小鼠中CBX7基因敲除以后，会致使其发生肺癌和肝癌。但在胃癌细胞中出现CBX7过表达现象，在此CBX7发挥致癌作用[11]，表明其具有致癌特性。到目前为止，关于CBX7结构研究的报道仅有两篇[15-16]，分别解析出的是N端7-62aa与C端219-248aa区域的结构，但并未指明其具体作用位点及机理。对于CBX7的分子生物学机理，以及其通过何种信号通路发挥作用，我们尚不明确。本课题旨在利用分子生物学方法获取CBX7蛋白用于结构和功能研究。然而，获取足量的全长CBX7蛋白并用于结构研究极为艰难。因此，我们的目标是通过解析CBX7功能结构域的立体构象，以找出其抗增殖潜能及生物学作用机制。我们知道，大肠杆菌E.Coil重组蛋白表达系统在蛋白质纯化过程中会导致部分蛋白形成不可溶的包含体，ppSUMO表达载体则具有增强蛋白质可溶性的功效，除此之外，ppSUMO表达载体还具有易纯化、易切除、表达量高、且带有多种可选择的酶切位点等特性。因此在本次实验中，我们选用了His-ppSUMO-CBX7的质粒构建形式。根据多种蛋白质二级结构在线预测软件和相关文献报道对CBX7二级结构和氨基酸排列无序性的分析结果，推测出CBX7各功能结构域边界，并通过ppSUMO表达系统设计了包括CBX7全长序列在内的26个片段，这些片段，尽可能得覆盖到CBX7有可能存在的各个功能区域。本课题利用分子生物学方法构建PP-SUMO-CBX7重组克隆并纯化出高纯度CBX7的部分功能结构域蛋白单体，为后续结构生物学相关研究奠定基础，同时为CBX7及其家族蛋白PCG在癌症发展及肿瘤因子靶向抑制研究提供新的思路和途径。文 中 阐 述 了 CBX7 部 分 功 能 结 构 域 片 段SUMO-CBX7-4(13-227aa) ， SUMO-CBX7-7(25-151aa) ， SUMO-CBX7-8(25-227aa) ， SUMO-CBX7-9(25-237aa) ， SUMO-CBX7-13(145-227aa) ， SUMO-CBX7-14 (145-237aa) ， SUMO-CBX7-N(62-219aa)重组表达载体构建的详细过程。构建成功的表达载体经过诱导高效可溶性表达，我们使用Ni-NTA亲和层析对目的融合蛋白进行初步纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot进行检测鉴定。纯化后的蛋白样品通过离子交换和分子筛层析进一步分离剩余杂质。本实验所得到的高浓度融合蛋白SUMO-CBX7-13(145-227aa)可用于结晶，为后续CBX7的结构和功能研究奠定基础。