论文部分内容阅读
目的: 血管内皮是循环血液和组织间的一层天然屏障,在维持血管的形态和功能中起到重要的作用。但血管内皮在机体内外环境的刺激下容易发生功能紊乱,导致血管功能障碍,进而造成血管损伤。本研究以内皮祖细胞(EPCs)分化成内皮细胞(ECs)为基础,研究补骨脂查尔酮促进EPCs分化的作用,并进一步在动物体内对内皮祖细胞的增殖、动员和分化以及对损伤血管的修复能力进行验证;最后本课题对补骨脂查尔酮通过促红细胞生成素(EPO)及AMPK通路促进内皮祖细胞分化的机制进行探究,为临床治疗心血管疾病提供依据。 方法: 1.密度梯度离心法及差速贴壁法提取分离EPCs,镜下观察其形态,采用免疫细胞荧光技术对其进行鉴定;并用不同浓度补骨脂查尔酮刺激新分离的EPCs统计其细胞集落数和分化后EPCs和ECs的比例; 2.建立大鼠后肢缺血模型,并给予补骨脂查尔酮,随后检测其后肢血流量,并对缺血组织区域进行HE染色,统计毛细血管数量;采用免疫荧光染色对新生毛细血管进行鉴定,并统计毛细血管长度;同时检测其外周血中的EPO含量; 3.建立SHR颈总动脉损伤模型,给予补骨脂查尔酮后,取损伤颈总动脉进行HE染色,统计颈总动脉的内中膜面积比; 4.将EPO荧光素报告质粒转染入HEK293细胞,加入不同浓度的补骨脂查尔酮,检测其对EPO启动子的活性的影响; 5.补骨脂查尔酮分别刺激HUVECs及EPCs,随后检测各细胞中EPO的mRNA和蛋白含量。 结果: 1.内皮祖细胞分化7d后,细胞形态发生改变,由球形细胞变为梭型细胞;经免疫荧光鉴定,该细胞表面受体CD34及vWF呈阳性;中低浓度的补骨脂查尔酮,可显著促进EPCs及ECs的数量; 2.补骨脂查尔酮对大鼠后肢血流的恢复具有促进作用;并且显著增加了大鼠后肢骨骼肌上的毛细血管数量及长度,且新生血管呈现CD34及CD31双阳性;同时补骨脂查尔酮也可显著提高大鼠血液中EPO的含量; 3.补骨脂查尔酮可显著降低大鼠颈总动脉的内中膜面积比,促进大鼠颈动脉损伤的修复; 4.EPO荧光素报告基因结果得出低浓度的补骨脂查尔酮显著提高EPO启动子的活性,尤以0.2μM补骨脂查尔酮使得EPO启动子的活性达到峰值; 5.补骨脂查尔酮分别刺激HUVEC细胞及EPCs,结果表明其可显著增强细胞内EPO的mRNA的表达,且HUVEC细胞中EPO蛋白含量也明显增加。 结论: 本课题建立了体外提取分离和鉴定内皮祖细胞的方法,并探究补骨脂查尔酮对内皮祖细胞的作用。体外实验表明补骨脂查尔酮可促进内皮祖细胞的分化。动物实验结果显示,补骨脂查尔酮对大鼠内皮祖细胞的增殖及动员具有促进作用,并加速了大鼠后肢缺血的恢复以及缺血组织的血管再生,同时也可促进大鼠颈动脉损伤的修复。随后本课题组对其作用机制进行探究,结果表明补骨脂查尔酮通过AMPK通路和对EPO蛋白的调控,促进了内皮祖细胞的增殖和动员,并加速其对血管损伤组织的修复。说明补骨脂查尔酮可作为一个潜在的治疗心血管疾病的药物,为心血管疾病的治疗提供了新的方向。