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藤黄生品有大毒,不能内服,内服必须要经过炮制,制藤黄毒性降低,开展中药藤黄炮制减毒机理的研究具有重要的意义。本研究从炮制前后多指标成分的变化和体内肠吸收差异的角度进行了藤黄炮制机理的探讨。 目的: 探索一种快速、有效地分离藤黄中指标成分的新方法;比较藤黄炮制前后的指标成分的变化;通过肠吸收转运屏障的成分分析,探究指标成分的吸收机制,比较藤黄主要成分炮制前后的吸收差异。 方法: pH区带精制逆流色谱结合高速逆流色谱法分离藤黄中的多指标成分;建立同时测定多指标成分的一测多评法,确定藤黄各生品和不同炮制品(高压蒸制、豆腐制、清水制和荷叶制)之间的成分含量变化;采用在体肠灌流模型结合Caco-2细胞模型,对藤黄炮制前后(生藤黄和清水制藤黄)的多指标成分进行UPLC-ESI-MS/MS检测,比较生、制藤黄中多指标成分的吸收速率常数(Ka)和表观渗透系数(Papp)。 结果: 采用pH区带精制逆流色谱结合普通高速逆流色谱成功地从藤黄中分离出主要的化学成分,分别为β-莫里林酸、异新藤黄酸、新藤黄酸、藤黄酸,纯度均大于95%,实现了对藤黄中主要成分的大量制备。制备分离得到2R-30-羟甲基藤黄酸、gambogellic acid。 建立了HPLC测定生、制藤黄中7个指标成分β-莫里林酸、异新藤黄酸、新藤黄酸、2R-藤黄酸、2S-藤黄酸、2R-30-羟甲基藤黄酸、gambogellic acid的一测多评法;以新藤黄酸为内标物,β-莫里林酸、异新藤黄酸、2R-藤黄酸、2S-藤黄酸、2R-30-羟甲基藤黄酸、gambogellic acid的相对校正因子分别为0.91、1.06、0.92、0.92、0.86、0.78;藤黄炮制后成分的种类没有变化,7个指标成分的含量都一定程度的降低。 生、制藤黄中的β-莫里林酸、异新藤黄酸、新藤黄酸、2R-藤黄酸、2S-藤黄酸的在体肠吸收机制均是被动扩散为主,且在不同肠段(十二指肠、空肠、回肠、结肠)的表观渗透系数(Papp)均大于2×10-6,吸收良好;与生藤黄比较,清水制藤黄中的各成分的吸收速率常数和表观渗透系数,在十二指肠和空肠有一定程度的升高,在回肠和结肠均降低。 在安全浓度范围内,由于新藤黄酸、藤黄酸、生藤黄以及清水制藤黄毒性高,浓度低,LC-ESI-MS/MS无法检测到。只对β-莫里林酸和异新藤黄酸的表观渗透系数和外排率进行了测定,其吸收机制均为被动扩散为主,β-英里林酸可能是P-gp蛋白的底物,异新藤黄酸可能是MRP2蛋白的底物。 结论: 采用pH区带精制逆流色谱结合普通高速逆流色谱法可以实现对藤黄中藤黄酸和新藤黄酸等成分的大量制备;建立一测多评法以一个成分来测定藤黄中多种化学成分的含量,克服了对照品缺乏的困难;藤黄炮制减毒的机理可能与炮制后指标成分β-莫里林酸、异新藤黄酸、新藤黄酸、2R-藤黄酸、2S-藤黄酸、2R-30-羟甲基藤黄酸、gambogellic acid含量的降低及β-莫里林酸、异新藤黄酸、新藤黄酸、2R-藤黄酸、2S-藤黄酸在肠道内的吸收差异有关。