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研究背景下腰痛影响着全球数百万人口的健康,其主要原因是椎间盘退变。椎间盘退变的治疗方式以物理治疗、药物止痛等保守对症治疗为主,部分患者在保守治疗数年后需要手术治疗。手术治疗并未考虑椎间盘退变的病理生理因素,手术治疗牺牲了脊柱的运动功能,存在麻醉风险和相邻节段椎间盘退变加速等问题。椎间盘退变主要特征是椎间盘细胞数量减少和细胞外基质成分含量改变,细胞外基质主要由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白构成,因此研究椎间盘退变后不同类型胶原蛋白含量的变化过程,寻找新的生物治疗靶点,对提高椎间盘退变患者的生活质量至关重要。研究发现,IL-13在椎间盘退变中占据重要作用,而sIL-13Rα2是个诱饵受体,可以阻断IL-13与IL-13Rα1/IL-4Rα结合,从而阻断IL-13的生物活性,因此推测sIL-13Rα2-Fc具有抑制椎间盘退变的作用。实验目的通过Masson染色观察纤维环穿刺后椎间盘退变组织的病理变化过程。为了检测椎间盘退变组织中胶原类型的变化情况,利用天狼猩红染色技术对组织胶原进行染色。利用RT-PCR和Western blot技术分别在转录水平和蛋白水平分析sIL-13Rα2-Fc干预后椎间盘组织中的I型胶原蛋白和II型胶原蛋白表达情况以及mRNA表达水平,探究sIL-13Rα2-Fc对椎间盘退变的影响。实验方法72只S-D大鼠,体重200g±20g,6-8w,随机分为A组、B组、C组、D组、E组、F组,共6组,每组12只。A组为空白对照组,B组为假手术组,C组为模型组,D组为sIL-13Rα2-Fc融合蛋白注射低剂量组,E组为sIL-13Rα2-Fc融合蛋白注射中剂量组,F组为sIL-13Rα2-Fc融合蛋白注射高剂量组。选取大鼠尾椎Co7/8、Co8/9及Co9/10椎间隙,采用纤维环穿刺损伤的方式建立大鼠椎间盘退变模型。7d后通过原手术路径给D组、E组、F组大鼠椎间盘纤维环注射给药,分别注射等剂量的不同浓度的sIL-13Rα2-Fc融合蛋白(低剂量0.5mg/kg、中剂量1mg/kg、高剂量2mg/kg);B组(造模后常规饲养)、C组在同等时间内注射等剂量生理盐水,A组不进行任何处理。按照采样需求,2周、4周、8周后通过脱颈法处死大鼠,每组4只。提取各组大鼠椎间盘组织,制作石蜡切片,通过Masson染色检测椎间盘组织病理学退变过程,通过天狼猩红染色技术对椎间盘组织胶原蛋白类型进行检测,然后提取椎间盘组织中的RNA和胶原蛋白,分别通过RT-PCR技术及WB检测退变椎间盘组织中I型胶原、II型胶原mRNA表达水平和I型胶原蛋白和II胶原蛋白含量的变化。实验结果1.Masson染色显示:sIL-13Rα2-Fc融合蛋白干预的D组、E组、F组与B组比较发现,sIL-13Rα2-Fc融合蛋白能明显改善大鼠椎间盘组织病理学染色情况。椎间盘染色的具体表现为纤维环排列均匀,断裂处减少,髓核细胞增多,髓核面积扩大,髓核区域均匀透亮且无蓝染的胶原纤维。F组髓核细胞数量比D组、E组更多,纤维环断裂更少;2.天狼猩红染色结果:A组大鼠椎间盘髓核为疏松的亮橙色网状结构,纤维环内层为宝石蓝色,显示髓核和纤维环内层较为丰富的II型胶原,纤维环外层显示为亮黄色,为I型胶原;内外层之间分界清楚,排列整齐;而B组大鼠椎间盘髓核组织为比较致密的黄色和绿色,提示II型胶原含量减少,纤维环结构紊乱,内外层黄色或者淡绿色,分界不清,基本融合在一起;sIL-13Rα2-Fc融合蛋白干预的D组、E组、F组则介于这两组之间,提示sIL-13Rα2-Fc能减缓椎间盘退变进程。3.RT-PCR技术检测椎间盘组织中I型胶原和II型胶原的mRNA表达水平提示:sIL-13Rα2-Fc融合蛋白干预的D组、E组、F组与B组相比,空白对照的A组和sIL-13Rα2-Fc融合蛋白干预的D组、E组、F组的II型胶原mRNA表达水平明显高于椎间盘退变模型的B组,并呈浓度依赖性和时间依赖性;而I型胶原mRNA表达水平明显低于椎间盘退变模型的B组,也呈浓度依赖性和时间依赖性;4.Western blot技术检测椎间盘组织中I型胶原和II型胶原蛋白表达水平提示:sIL-13Rα2-Fc融合蛋白干预的D组、E组、F组相比模型B组,sIL-13Rα2-Fc融合蛋白能通过上调II型胶原蛋白水平、下调I型胶原蛋白水平而改变椎间盘细胞外基质成分含量,进而减缓椎间盘退变。结论1.椎间盘的退变与胶原蛋白的含量变化有关,主要表现为I型胶原蛋白含量升高和II型胶原蛋白含量减少;2.sIL-13Rα2-Fc融合蛋白可以增加II胶原mRNA表达水平,降低I型胶原mRNA表达水平,进而降低I型胶原蛋白含量、增加II型胶原蛋白含量抑制椎兰州大学硕士学位论文sIL-13Rα2-Fc调节胶原mRNA表达水平抑制椎间盘退变机制的研究间盘退变,且具有浓度依赖性和时间依懒性,sIL-13Rα2-Fc融合蛋白浓度越高,作用时间越长,对椎间盘退变的抑制作用越强。