CD40配体（CD40 ligand，CD40L）是TNF超家族成员，表达于人活化的CD4~+T细胞表面，与存在于B细胞、抗原递呈细胞（APC）表面的相应受体CD40分子相互作用，参与促发并调节机体的特异性体液免疫和细胞免疫应答；其在免疫应答中的作用已在X-性连锁高IgM血症及CD40L基因敲除小鼠中得到充分体现；近年来，CD40L在肿瘤免疫治疗中的潜在应用价值正倍受关注。但迄今为止，国内、外尚无商品化的CD40L重组产品。鉴此，我们在国内率先采用基因工程技术克隆了编码人CD40L胞外段cDNA并在毕氏酵母GS115中进行表达，同时对重组的人可溶性CD40L潜在的生物学功能进行了系列探讨。 CD40L是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，由261个AA组成；46至261位AA构成CD40L分子的胞外段，具有与其相应受体CD40分子相互作用的结构域（receptor binding domain, RBD）；胞外段可被蛋白酶裂解以可溶性形式（soluble CD40 ligand, sCD40L）存在。sCD40L是否具有膜型CD40L（mCD40L）的生物学功能引起我们的极大兴趣；与此同时，sCD40L作为一种新型免疫调节因子在体外树突状细胞的诱导扩增及在肿瘤生物治疗方面的作用和价值亦是本研究的宗旨之一。 — — 一．＠WW－… 采用RTPCR法从活化的人T淋巴细胞中扩增CD40L胞外段编码 CDNA，即可溶性CD40L编码CDNA，并克隆入pSK质粒；CDNA序列经 测序证实正确后再导入 pPICZaA质粒的a信号肽序列中，重组构建成分泌 型表达载体叩＊＊0入s＊D4 M；8腑限狲性内切酶反应使之线性化，电转 化法将线性化的 pPICZaA七CD40L载体导入 GSlls毕氏酵母菌株，以同源 重组形式整合到酵母染色体的AOX位点，经Zeocin抗性筛选，得到能在 甲醇诱导下稳定分泌rhsCD40L的基因工程菌。应用全自动发酵装置进行发 酵，rhS删0L浸滴演运互酋加峪水发巨b袄经FPLC分离、纯化，获 得纯度达95％以上，分子量约30Kda的重组蛋白。矗顷【狸固日曲功哮进 snMtW＆＆ NM200 hi H．功SML助恻ie砒、成她功能的彤响 DC是己知体内功能最强的专职性抗原递呈细胞（APC人 能摄取、加工 并递呈抗原，刺激未致敏w ye）T细胞的增殖和活化从而启动机体的特异性 免疫应答。CD40信号不仅有助于DC的分化与成熟，反之DC的CD40信 号又能促进CD4ty细胞甚至直接促进CD87细胞的活化与效应功能的产 生。因此DC作为一种具有独特功能的免疫佐剂在肿瘤免疫治疗及感染性 疾病治疗中的作用倍受瞩目。但DC在体内含量甚微，众多学者正致力于 探索体外DC诱导和扩增的最佳途径及细胞因子的优化组合。‘本研究结果显示：在无 M。存在时，GMCSF＋K－4＋thSCD40L可有 效地诱导人外周单核细胞向DC的分化和成熟。诱导的DC具有典型的细胞 学形态特征和特殊的成熟表面标志（CD，CD80，CD83，HLADR等） 及摄取FITC血一、刺激同种混合淋巴细胞体外增殖反应（MLR）和分 4 rhsCD40L在毕氏酵母中的表达及其生物学功能的研究 中文摘要 泌nl 的能力；经rhsCD40L刺激的DC其细胞表面分子KDla、CD80、 CD83、HLAAIR）的表达水平高于经典的细胞因子组合组（GM（SF＋In－ 4＋M a人 更为有意义的是：hsCD40L激发的 DC表面趋化因子受体 CXCR的表bg呶平及对自体外周 T淋巴细胞的趋化（Lallswell test）能力 均高于或强于 INTF Q或 FL激发的 DCS。 尽管DC及DC疫苗的发展和应用前景令悯舞，然而令人棘手的是在 体内及肿瘤微环境中存在一些抑制性因子对DC成熟和功能产生的负性作 用，严重制约着DC的肿瘤兔疫治疗效果。fiq 可能是最主要的肿瘤性抑 制因子，它具有明显的抑制DC成熟和促进其异向分化的效应。本凋铂深汐 1霎CD4MBDC占聋廷厚旁田烙弦MO斑陆粥朗团囚欧错”尸人而日％卧 寄庙亵茄wC及茵泅囚迫垮蛀愧磁访bC… 研究 结果发现：在 GMCSF瓜4诱导第 4天的 P删中加入 nl Q0n咖） 培养至第8天，细胞多贴壁生长并呈巨噬细胞样形态，nd 显著地抑制了 DC的分化、成熟、抗原的摄取、MLR及IL－12的产生。若在GM（SF＋IL． 4诱导第4天的PBMC（未成熟DC）中同时加入rhsCD40一）和IL－ 10p加咖），或在经GMl SF瓜4什地CE吐OL诱导成熟的DC中再加入L－ 10，DC的分化、成熟及功能正常。实验结果表明：reCD40L的应用将为 体外大量而有效地扩增DC开辟一条新途径；而且经rhsCD40L激发的DC 具有桔抗 n1 对 DC负性作用的功能，从而能提高 DC肿瘤免疫治疗的效 果。鉴此，我们设想在临床输注DC时，可同时给予rhsCD40L，不仅可