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一、文献研究目的:揭示糖尿病中医辨证存在的问题,为其中医辨证的规范化提供方法和思路。材料与方法:收集《中医病证诊断疗效标准》、《中药新药临床研究指导原则》、《糖尿病中医防治指南》、统编《中医内科学》教材等权威文献的糖尿病辨证;检索2014~2018年中国知网、万方数据库收录的期刊中糖尿病中医辨证文献,进行整理分析,明确指出权威文献辨证之间、学术界辨证之间、权威文献辨证与学术界辨证之间,糖尿病(消渴)辨证存在的问题,进而为本病中医辨证的规范化提供方法和思路。结果1.权威文献比较中,《标准》与《原则》中DM辨证差异显著,累计共有阴虚热盛证、胃燥津伤证、肾阴亏虚证、阴阳两虚证、阴虚阳浮证、湿热困脾证、气阴两虚证、阴阳两虚,血瘀水停证、血瘀脉络证9证;《指南》所收录的5证均承袭了《标准》与《原则》;加上《中医内科学》特有的肺热津伤、气阴亏虚2证,权威文献累计共得11证。《原则》与《指南》是目前临床普遍参考的辨证标准。《中医内科学》参照次数中等水平,《标准》作为参考的研究较少。2.以2型糖尿病为例考察中医临床辨证,分为辨主证与兼证。主证包括权威文献中阴虚热盛证、胃热炽盛证、肾阴亏虚证、阴阳两虚证、阴虚阳浮证、气阴两虚证、阴阳两虚,血瘀水停证、血瘀脉络证、肺热津伤证、痰(热)互结证10证,另新增27证;频次位于前10的证中,脾虚湿盛证、肝郁气滞证、湿热血瘀证、肝胃郁热证未收录进权威文献。兼证包括《指南》中痰浊、血瘀两证,多了瘀、浊瘀、气滞血瘀、气阴两虚4证。结果显示临床上客观存在3种辨证模式:完全依从权威文献、在权威文献基础上有所变通、自行灵活推出新证。3.以气阴两虚证、阴虚热盛证为例考察症状构成,结果气阴两虚证共得59种症状,包含了权威文献气阴两虚证的所有症状,另新增34种症状;阴虚热盛证共得40种症状,包含了权威文献阴虚热盛证的所有症状(苔薄黄除外),另新增18种症状。两证新增的症状中,或同症异名、或与本病证无直接关系、或繁冗重复,这种不规范的症状增加,可能是导致自拟证出现的原因。结论:1.糖尿病中医辨证标准复杂多样,且互有差异;有证出多门的现象,在临床执行上缺乏约束力。2.2型糖尿病中医临床辨证五花八门,离散程度较大;各证所属症状繁杂,与所属症状对应关系不符,证与症状表述也不规范;部分证与症状缺乏客观性与科学性。3.做好相关部门的整合协调、重视DM所属症状的规范化、统一证名,规范辨证、开展前瞻性DM辨证规范研究是建立规范化标准的思路和方法。二、实验研究目的:揭示黄芪、葛根有效组分配伍对糖尿病模型大鼠胰岛素分泌的影响。通过研究糖尿病模型大鼠胰腺糖脂代谢、炎症反应以及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B-2(PI3K/Akt)信号转导通路,探讨黄芪、葛根组分配伍调节胰岛素分泌的作用机制。材料与方法:按照血糖因素及析因实验设计方案,将146只SPF级SD雄性大鼠随机分成10组,即(1)正常组,(2)模型组,(3)金芪降糖片组(1.47 g·kg-1),(4)黄芪黄酮组(0.039 g·kg-1),(5)黄芪皂苷组(0.104 g·kg-1),(6)葛根黄酮组(0.036g·kg-1),(7)黄芪黄酮+黄芪皂苷组(0.143 g·kg-1),(8)黄芪黄酮+葛根黄酮组(0.075g·kg-1),(9)黄芪皂苷+葛根黄酮组(0.140 g·kg-1),(10)黄芪黄酮+黄芪皂苷+葛根黄酮组(0.179 g·kg-1)。除正常组外,其他各组大鼠按46mg·kg-1标准1次性腹腔注射(ip)2%链脲佐菌素溶液(STZ)进行造模。造模第7天,尾静脉取血检测大鼠随机血糖水平,血糖≥16.8 mmol·L-1视为实验性糖尿病模型大鼠。造模同日灌胃给药,正常组、模型组给予等量蒸馏水10 m L·kg-1,各组连续给药30天。分别于给药前、给药第7天、第30天,血糖仪检测血糖水平;生化分析仪检测血清胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)水平;酶联免疫法(ELISA)检测胰腺胰岛素(INS)、脂联素(APN)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;实时荧光定量PCR法(q PCR)检测胰腺脂联素受体1(Adipo R1)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、过氧化物酶增殖激活受体α(PPARα)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、胰岛素受体底物2(IRS2)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B-2(Akt2)、糖原合成酶激酶3β(Gsk3β)m RNA表达;采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析。结果:1.黄芪葛根有效组分配伍对糖尿病模型大鼠药效学指标的影响。1.1对DM模型大鼠血糖的影响造模前,各组实验大鼠血糖无显著差异(P>0.05);造模7d后,与正常组比较,各造模组大鼠血糖水平均显著升高(P<0.05);造模30天后,与模型组比较,仅黄芪黄酮组分能显著降低DM模型大鼠血糖水平,黄芪皂苷、葛根黄酮未见显著作用,各组分配伍组血糖亦未见显著变化。1.2对DM模型大鼠血脂的影响与正常组比较,模型组大鼠血清TG、CHO水平均显著升高(P<0.05)。对于血清TG水平,除3组分合用外,黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮及组分两两配伍均有显著作用,差异有统计学意义(P<0.05);对于血清CHO水平,黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮及各组分配伍均有显著作用,差异有统计学意义(P<0.05)。1.3对DM模型大鼠胰岛素水平的影响与正常组比较,模型组大鼠INS水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,黄芪黄酮组、葛根黄酮组的INS水平增加(P<0.05)。黄芪皂苷对INS水平无显著作用,与黄芪黄酮配伍虽存在交互作用,但未能显著增加模型大鼠INS水平。其余配伍组INS水平均显著升高,且存在交互作用。以黄芪黄酮与葛根黄酮配伍促INS水平效果最优,亦优于组分单用。2.黄芪葛根有效组分配伍调节糖尿病模型大鼠胰岛素分泌的药效机制2.1对胰腺脂代谢相关因子表达的影响与正常组比较,模型组大鼠胰腺APN水平以及Adipo R1、AMPK、PPAPαm RNA表达均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮均能提升胰腺Adipo R1、PPAPαm RNA表达,但对APN水平无显著影响(P>0.05)。仅黄芪黄酮能显著调控胰腺AMPK m RNA表达。黄芪黄酮与黄芪皂苷、黄芪黄酮与葛根黄酮以及3组分配伍均能显著升高胰腺APN水平(P<0.05),但配伍之间无显著交互作用。黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍能协同调节胰腺Adipo R1 m RNA表达;黄芪黄酮与葛根黄酮配伍能协同调节胰腺Adipo R1、PPAPαm RNA表达;3组分合用能协同调控PPAPαm RNA表达。其中,黄芪黄酮与葛根黄酮配伍是提高Adipo R1 m RNA表达的最优组合;3组分合用是调控PPAPαm RNA表达的最优组合。2.2对胰腺炎症相关指标表达的影响与正常组比较,模型组大鼠胰腺IL-12、IL-15、TNF-α及p38MAPK m RNA表达升高(P<0.05)。对胰腺IL-15、TNF-α、p38MAPK m RNA的调控,黄芪、葛根各个组分配伍均存在显著交互作用(P<0.05);对胰腺IL-12的调控,仅黄芪黄酮与葛根黄酮配伍存在交互作用(P<0.05)。黄芪黄酮与葛根黄酮配伍是降低胰腺IL-12、IL-15、p38MAPK m RNA表达的最优组合;黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍是降低胰腺TNF-α水平的最优组合。2.3对胰腺PI3K/Akt信号转导通路表达的影响与正常组比较,模型组大鼠胰腺IRS2、PI3K、Akt2 m RNA表达降低,Gsk3βm RNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。对胰腺IRS2、Gsk3βm RNA的调控,黄芪、葛根各个组分配伍均存在显著交互作用;对胰腺PI3K m RNA的调控,仅黄芪黄酮与葛根黄酮配伍存在交互作用;对胰腺Akt2 m RNA的调控,黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍及3组分合用存在交互作用。黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍是调控IRS2、Gsk3βm RNA表达的最优组合;黄芪黄酮与葛根黄酮配伍是提高PI3K m RNA表达的最优组合;3组分合用是调控Akt2m RNA表达的最优组合。结论:1.黄芪与葛根有效组分配伍能不同程度促进INS分泌,黄芪黄酮与葛根黄酮配伍是促进INS分泌的最优组合。2.黄芪与葛根有效组分配伍促INS分泌的机制,可能与缓解胰腺脂毒性、抑制炎症反应、改善PI3K/Akt信号转导通路有关。3.组分配伍调节INS分泌时,黄芪黄酮多发挥主要效应;组分配伍协同调控的作用靶点,既存在一致性,又各有侧重;药物配伍对靶点的调节效应,既有协同,亦有拮抗作用,亦或各自为用。