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目的1筛查PRL-3和m TOR在不同髓系白血病细胞株中的表达情况。2构建不同慢病毒载体,研究PRL-3表达变化对髓系白血病细胞PI3K/Akt/m TOR信号通路的影响。3研究PRL-3抑制剂下调PRL-3表达对髓系白血病细胞生物学活性及PI3K/Akt/m TOR信号通路的影响。4研究m TOR抑制剂下调m TOR表达对髓系白血病细胞死亡的影响。5探讨联合应用PRL-3抑制剂和m TOR抑制剂能否协同促进髓系白血病细胞的死亡及可能机制。方法1采用q PCR和Western blot检测3种不同髓系白血病细胞株中PRL-3和m TOR m RNA与蛋白的表达情况。2构建慢病毒载体,分别下调K562细胞的PRL-3、过表达U937细胞的PRL-3,使用嘌呤霉素筛选稳转株,通过q PCR和Western blot验证慢病毒转染后的效果及m TOR的表达变化,并用Western blot检测PI3K/Akt/m TOR信号通路和自噬蛋白等变化。3 PRL-3抑制剂Pentamidine分别作用K562、U937细胞后,MTS法确定Pentamidine的实验浓度,q PCR和Western blot检测PRL-3和m TOR的表达变化,DNA倍体法、Annexin V-PE/7-AAD双染法、Western blot检测细胞的周期分布、凋亡、自噬等生物学活性的改变,Western blot检测PI3K/Akt/m TOR信号通路蛋白Akt、m TOR及其磷酸化蛋白的表达变化。4 m TOR抑制剂Rapamycin分别作用K562、U937细胞后,透射电镜观察细胞凋亡、自噬的情况。5联合应用Rapamycin和Pentamidine分别作用K562、U937细胞后,Western blot检测Bcl2、Bax、LC3B等凋亡和自噬相关蛋白的表达变化,探讨同时抑制m TOR和PRL-3表达促进K562、U937细胞死亡的可能机制。结果1在3种髓系白血病细胞株中,PRL-3 m RNA和蛋白在K562细胞中均较高程度表达,在Kasumi-1细胞中中等表达,在U937细胞中表达较低;m TOR m RNA和蛋白在K562细胞中较高表达,在Kasumi-1细胞中中等表达,在U937细胞中表达较低。2成功构建靶向PRL-3的特异性sh RNA慢病毒载体和PRL-3过表达慢病毒载体,分别感染K562、U937细胞使GFP得到稳定表达,确定最佳实验条件均为MOI=20+感染增强液P液,嘌呤霉素筛选出稳转株,通过q PCR和Western blot鉴定作用靶点能成功下调K562细胞中PRL-3 m RNA和蛋白、过表达U937细胞PRL-3 m RNA和蛋白;PRL-3下调后,K562-KD组细胞中m TOR m RNA和蛋白均下调（P<0.05）,PRL-3过表达后,U937-OE组细胞中m TOR m RNA和蛋白均上调（P<0.05）。Western blot检测结果显示:与对照组相比,K562-KD组中Akt蛋白表达无显著差异（P>0.05）,p-Akt、m TOR、p-m TOR蛋白表达均降低（P>0.05）,自噬蛋白ATG5表达增加（P<0.05）,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值降低（P<0.05）,Beclin-1蛋白表达无显著差异（P>0.05）;与对照组相比,U937-OE组Akt蛋白表达无显著差异（P>0.05）,p-Akt、m TOR、p-m TOR蛋白表达均增加（P<0.05）,自噬蛋白ATG5、Beclin-1表达无显著差异（P>0.05）LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值增加（P<0.05）。3 PRL-3抑制剂Pentamidine分别作用K562、U937细胞后,MTS法确定两株细胞的实验浓度分别为:4.960n M、3.838n M;PRL-3和m TOR的m RNA和蛋白表达水平均明显下调（P<0.05）。与各自的未给药组相比:MTS法显示,K562、U937细胞的生长均受到抑制（P<0.05）;流式细胞术周期和凋亡检测结果显示,K562、U937细胞处于G2/M期的比例均明显增多（P<0.05）,处于S期的细胞均明显减少（P<0.05）,总凋亡率均增加（P<0.05）;Western blot检测自噬蛋白显示,K562、U937细胞的ATG5表达均增加（P<0.05）,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值均降低（P<0.05）,Beclin-1蛋白的表达均无显著差异（P>0.05）;Western blot检测信号通路蛋白显示,K562、U937细胞的Akt蛋白均无明显变化（P>0.05）,p-Akt、m TOR、p-m TOR蛋白表达均降低（P<0.05）。4 m TOR抑制剂Rapamycin作用后,透射电镜观察发现,K562、U937细胞中均可见到明显的核固缩和凋亡小体,均未见到自噬小体。Rapamycin联合Pentamidine分别作用于K562、U937细胞后,与各自的Rapamycin作用组相比,Western blot检测结果显示,K562、U937细胞的Bcl2蛋白表达均无显著差异（P>0.05）,Bax蛋白表达均增加（P<0.01）,Bax/Bcl2比值增加（P<0.01）、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P<0.01）。结论1在m RNA和蛋白水平上,不同髓系白血病细胞株中PRL-3和m TOR表达趋势呈现一致性但表达水平不同,确定二者均较高表达的K562细胞、二者均低表达的U937细胞为后续实验细胞。2成功构建靶向PRL-3的特异性sh RNA慢病毒载体和PRL-3过表达慢病毒载体,筛选出PRL-3稳定下调的K562细胞、PRL-3稳定过表达的U937细胞。3 m TOR m RNA和蛋白的表达会随着PRL-3表达下调而减低,反之m TOR也会随着PRL-3的过表达而表达增高。4敲减PRL-3可抑制K562细胞的PI3K/Akt/m TOR信号通路,下调m TOR的表达,自噬水平降低;过表达U937细胞的PRL-3可激活PI3K/Akt/m TOR信号通路,上调m TOR的表达,自噬水平增高,说明PRL-3调控PI3K/Akt/m TOR信号通路可能影响细胞自噬。5PRL-3抑制剂Pentamidine可通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路,使细胞增殖受抑、周期阻滞、细胞凋亡,自噬水平减低,与结论3一致。6单用m TOR抑制剂Rapamycin能促进细胞死亡,诱导自噬水平增高;联合应用PRL-3抑制剂Pentamidine,PRL-3抑制剂能降低Rapamycin所诱导的保护性自噬,协同促进髓系白血病细胞的死亡。