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第一部分Geftinib耐药的肺腺癌H1975细胞株的特征鉴定目的：本研究的目的是为了验证肺腺癌H1975细胞株是否具有特征性的突变位点及其对Geftinib是否耐药。方法：肺腺癌H1975细胞进行基因测序明确是否含有T790M及L858R突变：MTT法进行肺腺癌H1975细胞Geftinib耐药性的鉴定。结果：基因测序表明H1975细胞株含有EGFR T790M及L858R突变,且对Geftinib的50%抑制浓度ICso值为39.176μM,符合Geftinib耐药细胞株的描述；结论：本实验用肿腺癌H1975细胞含有T790M及L858R突变,且对Geftinib耐药符合肺腺癌H975细胞株的特征。第二部分BEZ235体外对吉非替尼耐药的肺腺癌H1975细胞的作用及其机制研究目的：通过体外细胞实验,探讨PI3K/mTOR双靶点抑制剂BEZ235对Geftinib耐药的肿腺癌H1975细胞株增殖的影响及其对H1975细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用,试图明确在体外实验中BEZ235能否通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路从而克服T790M突变导致的Gefitinib耐药。方法：MTT分析法初步明确BEZ235单用或与Geftinib联合对肺腺癌H1975细胞增殖抑制的影响；细胞划痕试验检测BEZ235和Geftinib的不同组合对H1975细胞迁移能力的影响；Transwell小室侵袭试验了解BEZ235和Geftinib不同组合对H1975细胞侵袭能力的影响；流式细胞术测定经BEZ235和Geftinib作用后各组H1975细胞周期分布及凋亡情况；RT-PCR法检测BEZ235和Geftinib对H1975细胞PIK3CA、mTOR, VEGF基因转录水平表达的影响；细胞免疫荧光法检测BEZ235和Geftinib对H1975细胞p-mTOR的表达定位,初步判定表达的变化；Western blot检测BEZ235和Geftinib对H1975细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白AKT, p-AKT、S6、p-S6的影响。结果：BEZ235单独作用于H1975细胞的IC50为0.327μm,且有明显的浓度依赖性；与Geftinib联合后BEZ235的IC50值为0.073μM,与单用BEZ235有显著差异(P<0.05)。BEZ235与Geftinib联合对H1975细胞迁移和侵袭能力的影响比Geftinib单用差异有统计学意义(P<0.05)；BEZ235单用或与Gefitinib联合使H1975细胞的凋亡增加,与Geftinib组及空白组相比,差异有统计学意义(P<0.05),但G1期阻滞并没有差异性。BEZ235单用或与Geftinib联合在转录水平上促进PIK3CA的表达,抑制VEGF的表达,两药单用或联合对mTOR则均表现为抑制作用；Western blot表明BEZ235能抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路上磷酸化的p-Akt、p-S6蛋白表达,而对总Akt及S6蛋白的表达无显著影响。结论：BEZ235单独作用于H1975细胞对其增殖有抑制作用,与Geftinib联合有协同性增殖抑制作用,可用于下一步实验；通过体外实验表明PI3K/mTOR双靶点抑制剂BEZ235能下调PI3K/Akt/mTOR信号通路上的蛋白磷酸化水平,有效的抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路上肿瘤生长信号向下传递,从而克服EGFR T790M突变导致的Geftinib获得性耐药；BEZ235体外试验中能抑制人肺腺癌H1975细胞的迁移和侵袭能力,BEZ235能增加H1975细胞凋亡的比例,且随干预时间的延长有增加的趋第三部分BEZ235对BALB/c裸鼠H1975细胞移植瘤生长的作用及其机制研究目的：通过建立BALB/c裸鼠移植瘤模型,在体探讨BEZ235对Geftinib耐药肺腺癌H1975细胞BALB/c裸鼠移植瘤生长的影响及其对PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用,以期明确BEZ235能否在体内也是通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路从而克服Gefitinib耐药而抑制肿瘤的生长及有无抗血管生成作用。方法：32只BALB/c裸鼠分成四组,第一组为空白对照组(BLK),第二组为单用Gefitinib组(GEF),第三组为单用BEZ235组(BEZ),第四组为BEZ235与Gefitinib联合组(B+G),每组8只。BALB/c裸鼠H1975细胞移植瘤干预前后肿瘤生长曲线的绘制了解肿瘤生长有无差异；干预过程中比较BALB/c裸鼠各组成瘤时间和肿瘤体积有无差异性；干预后比较各组BALB/c裸鼠切取的肿瘤重量从而评价干预效果是否有差异；活体MRI成像从影像学方面了解干预与否对肿瘤生长的影响；通过H1975细胞皮下种植建立BALB/c裸鼠移植瘤模型,BALB/c裸鼠移植瘤的Western blot检测BEZ235和(或)Geftinib对H1975细胞表达磷酸化蛋白p-mTOR、VEGF的影响；各组BALB/c裸鼠切取肿瘤组织切片免疫组化检测VEGF. p-S6、CD31,了解p-S6表达有无差异,了解与肿瘤血管生成相关指标VEGF. CD31在肿瘤组织中表达的是否有差异,以明确在体内BEZ235是否有抗血管生成作用。结果：BALB/c裸鼠移植瘤研究表明BEZ235单用或与Gefitinib联合,BALB/c裸鼠H1975细胞移植瘤的生长延缓；活体MR成像、干预过程中测得的肿瘤体积及干预后切取的肿瘤重量与空白对照组、GEF单用组相比有显著性差异(P<0.01)；BALB/c裸鼠移植瘤Western blot表明体内BEZ235能抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路上p-mTOR表达,VEGF在BEZ235单用或与Geftinib联合组是下降的；移植瘤免疫组化分析表明BEZ235单用或与Geftinib联合使BALB/c裸鼠肿瘤组织中的VEGF和CD31表达显著下降,以联合组下降最显著(P<0.01)。结论：通过移植瘤实验表明,BEZ235单用或与Geftinib联合干预后肿瘤的生长曲线显示BEZ235单用抑制肺腺癌H1975细胞移植瘤的生长,与Geftinib联合有协同作用；干预结束后肿瘤重量、活体MR成像得出同样的结果；在移植瘤模型中BEZ235能降低肿瘤组织中p-S6. CD31、VEGF的表达从而抑制H1975细胞移植瘤的血管生成。