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目的探讨对碳青霉烯类抗菌药物耐药柠檬酸杆菌的耐药表型、基因型、同源性以及质粒介导的耐药机制,为临床抗感染治疗提供理论依据。方法25株碳青霉烯类抗菌药物耐药的弗氏柠檬酸杆菌收集自不同医院的住院患者的临床标本。应用法国梅里埃Vitek-2 Compact系统对菌株初步鉴定和药敏;改良Hodge试验和亚胺培南复合E-test检测菌株碳青霉烯酶;菌株携带的碳青霉烯酶等耐药相关基因通过PCR扩增和产物测序确认;脉冲场凝胶电泳检测菌株之间的同源性;S1核酸酶切的脉冲场凝胶电泳检测菌株携带的质粒数量;质粒液相接合试验和/或电转化实验检测菌株携带质粒转移特性;基于二代MiSeq和三代MinION测序平台获取菌株的序列及携带质粒的序列,使用BLASTN、ResFinder、ISFinder、the Tn Number Registry和INTEGRAL等软件分析质粒的移动元件和耐药基因等信息。质粒基因结构图使用Inkscape0.48.1软件绘制。结果在25株初步鉴定为弗氏柠檬酸杆菌中,依据ANI值（Average Nucleotide Identity,平均核苷酸一致性）计算重新对菌株分类鉴定,结果显示弗氏柠檬酸杆菌和Citrobacter portucalensis各9株、布氏柠檬酸杆菌6株和乌克曼柠檬酸杆菌1株。这些菌株对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物耐药,呈现多重耐药表型。25株菌中,24株改良Hodge试验为阳性,而金属酶试验中仅有18株呈现阳性。经PCR扩增和产物测序确认,25株中有16株菌携带blaNDM-1,6株携带blaKPC-2,2株菌携带blaIMP-4,1株菌未检出产碳青霉烯酶基因。经对25株菌高通测序的数据分析显示,每一株菌可携带β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、酰胺醇类等多种耐药基因,并与菌株的耐药表型相一致。基于测序的多位点序列分型显示,ST171型5株菌,ST116型4株,ST85型3株,ST17型2株,ST367型、ST252型、ST134型、ST62型和ST257型各1株,6株新ST型（ST400、ST401、ST402、ST403、ST405和ST406）。脉冲场凝胶电泳结果未显示这25株菌之间存在克隆聚集性。基于MiSeq和MinION测序平台获得CRE3菌株携带的pCRE3-KPC质粒的全序列（Accession no.MH919378）。生物信息学分析显示该质粒是一种新的IncR/IncP6杂合质粒,它携带了blaKPC-2基因簇和新型Tn6626转座子。而Tn6626又由新型Tn3家族元件ISCfr16,截短的aacC2-tmrB区域和ISEc21组成。结论研究结果显示这25株柠檬酸杆菌携带多种耐药基因,呈现多重耐药。经检索,携带碳青霉烯类耐药基因的C.portucalensis和CRE3菌株携带的pCRE3-KPC质粒是一种新型的IncR/IncP6杂合质粒,这都是国内外首次报道。因此,需要加强对碳青霉烯类耐药肠杆菌的监测力度和合理使用抗菌药物。