阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以进行性认知功能减退为主要临床特征的神经退行性疾病,脑内β-淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)斑块沉积和神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)是AD常见的分子病理学特征。实际上,Aβ和NFTs的形成、炎症、氧化应激与神经元能量缺乏相关,临床证据显示家族型AD病人发病早期,脑部已经出现了葡萄糖代谢方式的改变和葡萄糖利用率的降低。AD脑部葡萄糖利用的减少与AD后期认知功能异常相关,脑部能量供给不足进一步加快了AD病程的发生发展。AD脑内神经元对葡萄糖摄取减少、线粒体电子传递链活性减弱和氧化应激产物增加更是神经元损伤的重要因素。此时,神经元及时的能量供给是维持神经元活动所必须。另一方面,线粒体功能受损,代偿性增强的糖酵解途径成为神经活动主要的能量支撑,神经细胞能量代谢方式从以线粒体的有氧氧化为主转变为糖酵解途径主导。糖酵解途径产生的乳酸对维持脑部活动有重要作用,尤其在葡萄糖不足的时候,乳酸成为大脑主要的能量来源。中枢神经系统(central nervous system,CNS)中,神经元的乳酸主要来源于少突胶质细胞和星形胶质细胞内葡萄糖的分解代谢。少突胶质细胞和星形胶质细胞产生的乳酸在单羧酸转运体(monocarboxylate transporters,MCTs)的协助下转运入神经元。目前已知的表达于CNS的MCTs包括单羧酸转运体1(monocarboxylate transporter 1,MCT1)、单羧酸转运体2(monocarboxylate transporter 2,MCT2)和单羧酸转运体4(monocarboxylate transporter 4,MCT4)。MCT1主要分布于少突胶质细胞以及包绕于神经元轴突的髓鞘组织,神经元主要表达MCT2,MCT4主要表达于星形胶质细胞。MCT1参与少突胶质细胞或髓鞘内乳酸的转运,MCT4介导星形胶质细胞内乳酸的转运,MCT2协助MCT1和MCT4促进胶质细胞内乳酸向神经元的转运。最重要的是,少突胶质细胞表面MCT1介导的髓鞘向神经元轴突的乳酸转运对维持神经元正常的生理功能和活动有重要作用。另外,少突胶质细胞形成的髓鞘组织更是参与神经兴奋性传导的重要结构。因此,本课题着重分析了少突胶质细胞表面MCT1表达水平的改变与AD中神经元损伤的相关性,并进一步探索了AD中少突胶质细胞形成的髓鞘结构的损伤与神经元损害的关系。首先探讨了生理情况下前额叶皮层(medial prefrontal cortex,mPFC)区MCT1表达水平的改变与神经元数量变化的关系;然后重点分析了AD中MCT1参与的乳酸代谢改变与神经元损伤的关系;最后阐述了AD中少突胶质细胞形成的髓鞘结构的损伤与神经元损害的潜在关系。主要结果如下:1.MCT1表达水平改变与神经元数量变化相关免疫蛋白印迹(western blot,WB)的结果表明,MCT1在mPFC区的表达量从第1周的低水平逐渐增加到第3周的高水平(n=3,*P<0.05),并在第3周和第6周保持在较高的表达水平(n=3,*P<0.05)。第7周和第8周,MCT1在mPFC区的表达量逐渐下降到较低水平,与第1周和第2周的表达量无显著差异(n=3,P>0.05)。MCT1在mPFC区的表达水平逐渐从第1个月的高水平降低到第8个月的低水平(n=3,*P<0.05),并在第8个月到第12个月一直处于低表达水平,低于第1个月的表达量(n=3,*P<0.05)。第1个月到第7个月MCT1的表达量无显著改变(n=3,P>0.05)。MCT1免疫荧光染色阳性细胞计数发现12个月内mPFC区MCT1阳性细胞数量的变化趋势与WB的结果一致。MCT1阳性细胞数量从第1周的低水平逐渐增加到第3周的高水平(n=3,*P<0.05);MCT1的阳性细胞数量在第3周到第6周保持在较高的表达水平,高于第1周的水平(n=3,*P<0.05)。第7周和第8周MCT1阳性细胞数量与第1周和第2周无显著差异(n=3,P>0.05)。MCT1阳性细胞数量从第1个月的高水平逐渐减少到第8个月的低水平(n=3,*P<0.05);并在第8个月到第12个月保持在较低的水平,均低于第1个月的水平(n=3,*P<0.05)。第1个月到第7个月MCT1阳性细胞数量无显著差异(n=3,P>0.05)。以上结果提示第6周MCT1的表达量高于第1周和第12个月MCT1的表达水平。因此,我们进一步对1周龄、6周龄和12个月龄的C57BL/6小鼠进行了MCT1和神经元核(neuronal neucli,Neu N)的免疫荧光双重标记染色,检测了MCT1表达水平的差异与神经元数量改变的相关性。实验结果显示,虽然MCT1与Neu N标记的神经元不共定位表达,但是1周龄、6周龄和12个月龄C57BL/6小鼠脑内神经元数量的变化趋势与MCT1阳性细胞数量的改变趋势一致。统计结果表明,与第1周和第12个月相比,第6周mPFC区神经元的数量增加(n=3,*P<0.05),第1周与第12个月神经元数量无显著差异(n=3,P>0.05)。mPFC区MCT1在第6周的表达水平高于第1周和第12个月MCT1的表达量(n=3,*P<0.05),第1周与第12个月mPFC区MCT1的表达量无显著差异(n=3,P>0.05)。最值得关注的是,关联分析发现第1周,第6周和第12个月mPFC区MCT1阳性细胞数量的变化与神经元数量的改变存在相关性(R=0.86,***P<0.001)。2.MCT1发育性地表达于少突胶质细胞通过对mPFC区MCT1和Neu N的表达分析,发现MCT1不表达于Neu N标记的神经元,因此我们继续检测了MCT1在神经元轴突的表达情况。分别对1周龄、6周龄和12个月龄C57BL/6小鼠进行了MCT1和神经元轴突标志物,非磷酸化神经丝(non-phosphorylated neurofilament,SMI-32)的免疫荧光双重标记染色。结果显示MCT1部分表达于神经元轴突,主要位于神经元轴突周围。不仅如此,通过对6周龄C57BL/6小鼠MCT1和MBP的免疫荧光双重标记染色,发现MCT1主要表达于少突胶质细胞。因此,我们进一步分析了不同鼠龄(1-8周龄、1-12个月龄)C57BL/6小鼠mPFC区MCT1在少突胶质细胞内的表达情况。如结果所示,MCT1与少突胶质细胞共定位表达,并且少突胶质细胞数量在12个月内的变化趋势与MCT1表达量的改变趋势一致。少突胶质细胞的数量从第1周的低水平逐渐增加到第3周的高水平(n=3,*P<0.05)。第3周到第6周少突胶质细胞数量多于第1周少突胶质细胞数量(n=3,*P<0.05)。与第1周和第2周相比,第7周和第8周少突胶质细胞数量无显著改变(n=3,P>0.05)。通过对1个月龄到12个月龄C57BL/6小鼠脑内MCT1与MBP表达水平的分析发现,与MCT1表达量变化趋势一致,第8个月到第12个月少突胶质细胞数量减少,低于第1个月少突胶质细胞的数量(n=3,*P<0.05)。第1个月到第7个月,少突胶质细胞数量无显著改变(n=3,P>0.05)。关联分析发现,不同鼠龄(1-8周龄、1-12个月龄)C57BL/6小鼠mPFC区MCT1表达量的变化与少突胶质细胞数量的改变具有相关性(R=0.88,***P<0.001)。3.星形胶质细胞和小胶质细胞的数量在12个月内无显著改变,且不表达MCT1WB和免疫荧光双重标记染色分别检测了12个月内mPFC区星形胶质细胞和小胶质细胞的数量变化情况,以及MCT1在星形胶质细胞和小胶质细胞内的表达情况。胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和抗CD11b/c抗体(Anti-CD11b/c antibody,OX42)分别用于标记星形胶质细胞和小胶质细胞。结果显示不同鼠龄(1-8周龄、1-12个月龄)C57BL/6小鼠mPFC区GFAP和OX42的相对表达量无显著差异(n=3,P>0.05)。并且MCT1不与星形胶质细胞和小胶质细胞共定位表达。4.AD中Aβ斑块和星形胶质细胞数量增加,神经元和少突胶质细胞数量减少免疫荧光染色的结果显示,APP/PS1小鼠与野生型C57BL/6小鼠皮层和海马CA1区Aβ斑块数量有显著性差异(n=4,**P<0.01)。WB半定量分析,发现APP/PS1小鼠脑内Aβ的表达水平显著高于野生型C57BL/6小鼠脑内Aβ的表达量(n=4,*P<0.05)。不仅如此,与野生型C57BL/6小鼠相比,APP/PS1小鼠皮层和海马CA1区的神经元数量减少(n=4,*P<0.05),少突胶质细胞数量减少(n=4,*P<0.05),星形胶质细胞数量增加(n=4,*P<0.05)。5.AD中脑组织乳酸水平和MCT1,2,4表达量下调乳酸检测试剂盒和WB实验分别检测了APP/PS1小鼠和野生型C57BL/6小鼠脑内乳酸含量和MCT1,2,4的表达水平。结果显示,APP/PS1小鼠脑组织乳酸含量较野生型C57BL/6小鼠减少(n=4,*P<0.05)。与野生型C57BL/6小鼠相比,APP/PS1小鼠脑内MCT1,2,4的相对表达水平降低(MCT1:n=4,**P<0.01;MCT2:n=4,*P<0.05;MCT4:n=4,*P<0.05)。为了明确APP/PS1小鼠脑内MCT1,2,4的表达水平和细胞分布情况,我们进一步对APP/PS1小鼠和野生型C57BL/6小鼠脑组织切片进行了MCT1与MBP、MCT2与Neu N以及MCT4与GFAP的免疫荧光双重标记染色。如结果所示,APP/PS1小鼠和野生型C57BL/6小鼠皮层和海马CA1区均可见MCT1与MBP、MCT2与Neu N、MCT4与GFAP的共定位表达。统计分析发现,APP/PS1小鼠皮层和海马CA1区MCT1,2,4阳性表达区域的累计光密度值(integrated optical density,IOD)低于野生型C57BL/6小鼠皮层和海马CA1区MCT1,2,4阳性表达的IOD值(MCT1:n=4,*P<0.05;MCT2:n=4,*P<0.05;MCT4:n=4,*P<0.05)。6.AD中神经元内乳酸代谢酶LDHA和LDHB的表达改变LDHA与Neu N以及LDHB与Neu N的免疫荧光双重标记染色,用于检测APP/PS1小鼠神经元内乳酸代谢酶的表达改变,其中LDHA与Neu N或者LDHB与Neu N共标的区域被认定为神经元内表达的LDHA或LDHB。结果表明,与野生型C57BL/6小鼠比较,APP/PS1小鼠皮层和海马CA1区神经元内LDHA和LDHB的相对表达水平下调,其中神经元内LDHB表达水平的降低更明显(皮层:n=4,*P<0.05;海马CA1:n=4,*P<0.05;)。不仅如此,通过对神经元内LDHA与LDHB表达水平的比值分析发现,与野生型C57BL/6小鼠相比,APP/PS1小鼠皮层和海马CA1区神经元内LDHA与LDHB的比值增加(皮层:n=4,*P<0.05;海马CA1:n=4,**P<0.01)。7.AβO组第3周出现髓鞘损伤,第8周可见神经元损害采用了MBP和神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF200)的免疫荧光双重标记染色,分析了第3周和第8周Control组、Sham组和AβO组胼胝体区髓鞘和神经元纤维的损伤情况。统计显示,第3周,与Control组相比,AβO组胼胝体区MBP表达水平降低(n=5,*P<0.05),Control组与Sham组胼胝体区MBP的表达水平无显著差异(n=5,P>0.05)。第3周Control组、Sham组和AβO组胼胝体区NF200的表达水平无显著差异(n=5,P>0.05)。第8周,与Control组比较,AβO组胼胝体区MBP的表达水平减少(n=5,*P<0.05),Control组与Sham组胼胝体区MBP的表达量无显著差异(n=5,P>0.05)。第8周,AβO组胼胝体区NF200的表达量较Control组降低(n=5,*P<0.05),Control组和Sham组胼胝体区NF200的表达水平无显著差异(n=5,P>0.05)。8.第8周AβO组可见海马、胼胝体和皮层区的神经元损伤尼氏染色和免疫染色技术继续检测了第8周Control组、Sham组和AβO组海马、胼胝体和皮层区神经元数量和神经元纤维密度的差异。结果显示,Control组和Sham组海马CA1和CA3区神经元数量无显著差异(CA1:n=5,P>0.05;CA3:n=5,P>0.05)。与Control组比较,AβO组海马CA1和CA3区神经元数量减少(CA1:n=5,*P<0.05;CA3:n=5,*P<0.05)。通过对NF200免疫荧光染色分析发现,Control组和Sham组胼胝体区NF200的光密度(optical density,OD)无显著差异(n=5,P>0.05)。AβO组与Control组胼胝体区NF200的OD值有显著差异(n=5,*P<0.05)。通过对Control组、Sham组和AβO组皮层区Neu N的免疫组织化学染色和OD值分析发现,Control组和Sham组皮层区Neu N的OD值无显著差异(n=5,P>0.05)。与Control组比较,AβO组皮层区Neu N的OD值降低(n=5,*P<0.05)。9.第8周AβO组星形胶质细胞和小胶质细胞数量增加GFAP和同种异体移植炎症因子(allograft inflammatory factor 1,AIF-1)分别用于标记星形胶质细胞和小胶质细胞。统计发现,第3周,AβO组皮层区GFAP和AIF-1的表达水平与Control组相比无显著差异(n=5,P>0.05)。Control组和Sham组皮层区GFAP和AIF-1的表达量也无显著差异(n=5,P>0.05)。第8周,与Control组相比,AβO组皮层区GFAP和AIF-1的表达水平增加(n=5,*P<0.05)。Control组和Sham组皮层区GFAP和AIF-1的表达量无显著差异(n=5,P>0.05)。10.AβO体外干预引起了少突胶质细胞数量和MBP阳性标记区域的减少离体实验观察了AβO对OPCs分化为成熟少突胶质细胞的影响。与Control组相比,AβO组少突胶质细胞数量减少(n=5,*P<0.05),Control组与Sham组少突胶质细胞数量无显著差异(n=5,P>0.05)。通过对各组少突胶质细胞MBP阳性表达区域的统计分析,发现AβO组少突胶质细胞MBP阳性表达区域较Control组减少(n=5,*P<0.05),Control组与Sham组少突胶质细胞MBP阳性表达区域无显著差异(n=5,P>0.05)。综上,本研究首先阐明了生理情况下MCT1表达水平的变化与神经元数量改变相关,并且MCT1发育性地表达于少突胶质细胞;然后明确了AD中MCT1表达量降低与神经元损伤相关,并且进一步阐明了MCT1参与的乳酸代谢改变是导致神经元损害的重要因素;最后证实了AD中少突胶质细胞形成的髓鞘结构的损伤发生不仅早于神经元损害,还早于星形胶质细胞和小胶质细胞数量的增加,提示早期脱髓鞘改变与神经元损伤相关,同时明确了AβO对OPCs直接的毒性作用是AD早期脱髓鞘改变的主要原因。基于以上结果,本研究提出以下推论:AD发病过程中,MCT1表达量下调与少突胶质细胞形成的髓鞘结构破坏,引起了少突胶质细胞内乳酸向神经元转运的障碍,从而导致了神经元内乳酸等能量底物的不足,加重了神经元的损害。因此,AD发病过程中,特别是AD早期阶段上调少突胶质细胞表面MCT1的表达水平和促进髓鞘再生修复,可以改善AD中神经元的能量代谢,减轻神经元损伤,推迟AD的发生发展。