论文部分内容阅读
缺血性脑卒中是临床常见病和多发病,其治疗基础主要为梗死组织周边缺血半暗带的血流恢复,但有时缺血区血流恢复后引起的再灌注损伤会导致脑组织损伤程度进一步加重。细胞自噬是影响脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤发生发展的重要机制。自噬是一种受多条信号通路调控的复杂过程,其中AMPK/DDiT4/mTOR信号通路在自噬的启动过程中发挥了关键作用。中药黄芪味甘,性微温,广泛应用于气虚血瘀型脑血管病的临床治疗。黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一,具有清除氧自由基、抗炎、抗血小板聚集等生物活性。黄芪甲苷是否通过AMPK/DDiT4/mTOR信号通路激活自噬?是否通过激活自噬而发挥对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用?尚未见报道。因此,本研究采用黄芪甲苷干预脑I/R损伤,探讨黄芪甲苷是否通过AMPK/DDiT4/mTOR自噬信号通路调控自噬发挥对脑I/R损伤的神经保护作用。本研究采用SD大鼠和HT22细胞分别通过在体实验和离体实验模拟脑I/R损伤过程。研究共分为三个部分:1、观察黄芪甲苷对脑I/R损伤的神经保护作用;2、研究黄芪甲苷是否通过调控自噬发挥对脑I/R损伤的神经保护作用;3、探索黄芪甲苷是否通过AMPK/DDiT4/mTOR自噬信号通路对脑I/R损伤发挥神经保护作用。第一部分黄芪甲苷对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用研究目的:通过建立在体和离体脑I/R损伤模型,观察黄芪甲苷对脑I/R损伤的神经保护作用。方法:采用成年Sprague Dawley(SD)大鼠和小鼠海马神经元细胞系HT22细胞分别通过大脑中动脉阻塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)法和缺氧缺糖/复氧复糖(Oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)法模拟脑缺血再灌注损伤过程。在体实验分为假手术组(Sham),模型组(MCAO/R)和黄芪甲苷组(MCAO/R+AS-IV)(20mg/kg),采用Zea Longa神经功能学评分、TTC染色、HE染色、Tunel染色、免疫组化染色及透射电子显微镜观察黄芪甲苷对MCAO/R大鼠的神经保护作用。离体实验分为正常对照组(Control),模型组(Model),溶剂对照组(DMSO)和黄芪甲苷组(AS-IV)(50,100,150,200μmol/L),采用CCK-8检测、LDH检测及免疫荧光检测、流式细胞术检测观察黄芪甲苷对OGD/R HT22细胞的神经保护作用。结果:在体实验:(1)神经功能缺损情况:Zea Longa神经功能学评分结果显示,与Sham组比较,MCAO/R组大鼠神经功能学评分显著升高(P<0.01);与MCAO/R组比较,MCAO/R+AS-IV组大鼠神经功能学评分显著降低,神经缺损症状显著缓解(P<0.01)。(2)脑梗死体积:TTC染色结果显示,与Sham组比较,MCAO/R组大鼠左侧脑组织出现大范围梗死(P<0.01);与MCAO/R组比较,MCAO/R+AS-IV组大鼠脑组织梗死体积显著缩小(P<0.01)。(3)脑组织形态结构:HE染色结果显示,Sham组大鼠脑组织结构正常;MCAO/R组大鼠梗死灶内神经元细胞核固缩深染、神经元大量丢失;MCAO/R+AS-IV组大鼠脑组织损伤情况较MCAO/R组显著缓解。(4)脑组织神经元超微结构:透射电子显微镜观察发现,Sham组大鼠脑组织神经元结构正常。MCAO/R组大鼠脑组织神经元细胞核膜不规则、断裂、溶解,核内异染色质增多,线粒体肿胀变圆,胞质内有许多空泡结构形成。与MCAO/R组比较,MCAO/R+AS-IV组大鼠脑组织神经元上述情况明显缓解。(5)细胞凋亡率:Tunel染色结果显示,与Sham组比较,MCAO/R组大鼠脑组织细胞凋亡率显著升高(P<0.01);与MCAO/R组比较,MCAO/R+AS-IV组大鼠脑组织细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。(6)Bax/Bcl-2:免疫组化染色结果显示,与Sham组比较,MCAO/R组大鼠脑组织Bax/Bcl-2显著升高(P<0.01);与MCAO/R组比较,MCAO/R+AS-IV组大鼠脑组织Bax/Bcl-2显著降低(P<0.01)。离体实验:(1)细胞存活率:CCK-8检测结果显示,与Control组比较,Model组细胞存活率显著下降(P<0.01);与Model组比较,不同浓度AS-IV均能有效提高OGD/R HT22细胞存活率(P<0.01),其中100μmol/L黄芪甲苷治疗效果最佳,DMSO组细胞存活率与Model组比较无明显差别。(2)细胞LDH漏出率:LDH检测显示,与Control组比较,Model组细胞LDH漏出率显著上升(P<0.01);与Model组比较,不同浓度AS-IV均能降低LDH漏出率(P<0.01),其中100μmol/L黄芪甲苷治疗效果最佳,DMSO组细胞LDH漏出率与Model组比较无明显差别。(3)细胞凋亡率:流式细胞术检测结果显示,与Control组比较,Model组细胞凋亡率显著升高(P<0.01);与Model组比较,100μmol/L AS-IV组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。(4)Bax/Bcl-2:免疫荧光染色发现,与Control组比较,Model组细胞Bax/Bcl-2值显著升高(P<0.01);与Model组比较,100μmol/L AS-IV组Bax/Bcl-2显著降低(P<0.05)。小结:黄芪甲苷显著降低MCAO/R大鼠神经功能学评分、缩小脑梗死体积、减轻脑组织细胞凋亡及神经元损伤程度,对MCAO/R大鼠脑组织发挥神经保护作用;同时,黄芪甲苷可提高OGD/R HT22细胞存活率、降低LDH漏出率、降低Bax/Bcl-2及细胞凋亡率,对ODG/R HT22细胞具有保护作用。第二部分黄芪甲苷激活自噬发挥对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用研究目的:通过MCAO/R大鼠模型和OGD/R HT22细胞模型观察黄芪甲苷对脑I/R损伤后细胞自噬的影响,探讨黄芪甲苷是否可通过调控自噬发挥对脑I/R损伤的神经保护作用。方法:(1)建立MCAO/R动物模型,将MCAO/R大鼠随机分为假手术组(Sham),模型组(MCAO/R)和黄芪甲苷组(MCAO/R+AS-IV)(20mg/kg),通过Western Blot检测大鼠脑组织P62、Beclin1和LC3表达。(2)建立OGD/R细胞模型,将细胞随机分为正常对照组(Control),模型组(Model),黄芪甲苷组(AS-IV)(100μmol/L),黄芪甲苷+自噬抑制剂组(AS-IV+3ma),自噬抑制剂组(3ma)(5mmol/L)和自噬激活剂组(Rapa)(250nmol/L)。通过Western Blot检测P62、Beclin1和LC3表达以及透射电子显微镜观察细胞内自噬小体数量,观察黄芪甲苷对OGD/R后细胞自噬的影响。通过CCK-8检测,LDH检测,Bax、Bcl-2免疫荧光检测,Caspase-3的Western Blot检测及流式细胞术检测,观察自噬对黄芪甲苷神经保护作用的影响。(3)建立OGD/R细胞模型,将细胞随机分为正常对照组(Control),模型组(Model),黄芪甲苷组(AS-IV),黄芪甲苷+Beclin1基因沉默组(AS-IV+Beclin1-/-),Beclin1基因沉默组(Beclin1-/-)。通过CCK-8法检测细胞存活率、LDH法观察细胞LDH漏出率、Western Blot检测细胞内Caspase-3表达,进一步证实自噬对黄芪甲苷在脑I/R损伤中神经保护作用的影响。结果:在体实验:P62、Beclin1表达及LC3II/LC3I:Western Blot检测结果显示,与Sham组比较,MCAO/R组大鼠脑组织P62表达显著下降(P<0.01),Beclin1表达和LC3II/LC3I均显著升高(P<0.01);与MCAO/R组比较,MCAO/R+AS-IV组大鼠脑组织P62表达显著下降(P<0.01),Beclin1表达和LC3II/LC3I均显著升高(P<0.01)。离体实验:⑴应用自噬抑制剂和激活剂方法的实验结果:(1)P62、Beclin1及LC3II/LC3I表达:Western Blot检测结果显示,与Control组比较,Model组细胞P62表达显著下降(P<0.01),Beclin1表达、LC3II/LC3I均显著升高(P<0.01);与Model组比较,AS-IV组和Rapa组细胞P62表达显著下降(P<0.01),Beclin1表达、LC3II/LC3I均显著升高(P<0.01),AS-IV+3ma组和3ma组P62表达显著升高(P<0.01),Beclin1表达及LC3II/LC3I均显著降低(P<0.01);与AS-IV组比较,AS-IV+3ma和3ma组细胞P62蛋白显著升高(P<0.01),Beclin1蛋白表达和LC3II/LC3I显著降低(P<0.01),Rapa组LC3II/LC3I显著升高(P<0.01)。(2)细胞内自噬小体数量:透射电子显微镜观察显示,与Control组比较,Model组细胞内自噬小体数量显著升高(P<0.01);与Model组比较,AS-IV组和Rapa组细胞内自噬小体数量进一步提高(P<0.01),AS-IV+3ma组与3ma组细胞内自噬小体数量与Model组比较显著降低(P<0.05);与AS-IV组比较,AS-IV+3ma组及3ma组细胞自噬小体数量显著下降(P<0.01),Rapa组与AS-IV组比较无显著差别。(3)细胞存活率:CCK-8检测结果显示,与Control组比较,Model组细胞存活率显著下降(P<0.01);与Model组比较,AS-IV组和Rapa组细胞存活率显著升高(P<0.01),3ma组细胞存活率显著下降(P<0.01),AS-IV+3ma组细胞存活率与Model组比较无差别;与AS-IV组比较,AS-IV+3ma、3ma组和Rapa组细胞存活率均显著下降(P<0.01)。(4)LDH漏出率:LDH检测结果显示,与Control组比较,Model组细胞LDH漏出率显著升高(P<0.01);与Model组比较,AS-IV组和Rapa组细胞LDH漏出率显著下降(P<0.01),AS-IV+3ma组和3ma组细胞LDH漏出率均显著升高(P<0.05);与AS-IV组比较,AS-IV+3ma、3ma组和Rapa组细胞LDH漏出率显著升高(P<0.05)。(5)Bax/Bcl-2:免疫荧光染色结果显示,与Control组比较,Model组细胞Bax/Bcl-2显著升高(P<0.01);与Model组比较,AS-IV组和Rapa组细胞Bax/Bcl-2显著降低(P<0.05),3ma组细胞Bax/Bcl-2显著升高(P<0.01),AS-IV+3ma组细胞Bax/Bcl-2与Model组比较无显著差异;与AS-IV组比较,AS-IV+3ma组及3ma组细胞Bax/Bcl-2显著升高(P<0.01),Rapa组与AS-IV组比较无显著差别。(6)Caspase-3表达:Western Blot检测结果显示,与Control组比较,Model组细胞Caspase-3表达显著升高(P<0.01);与Model组比较,AS-IV组和Rapa组Caspase-3表达均显著下降(P<0.01),AS-IV+3ma组和3ma组Caspase-3表达显著升高(P<0.01);与AS-IV组比较,AS-IV+3ma组及3ma组细胞Caspase-3表达显著升高(P<0.01),Rapa组与AS-IV组比较无显著差别。(7)细胞凋亡率:流式细胞术检测结果显示,与Control组比较,Model组细胞凋亡率显著升高(P<0.01);与Model组比较,AS-IV组和Rapa组细胞凋亡率显著下降(P<0.05),3ma组细胞凋亡率显著升高(P<0.01),AS-IV+3ma组细胞凋亡率与Model组比较无显著差异;与AS-IV组比较,AS-IV+3ma组及3ma组细胞凋亡率显著升高(P<0.01),Rapa组与AS-IV组比较无显著差别。⑵应用Beclin1基因沉默方法的实验结果:(1)细胞存活率:CCK-8检测结果显示,与Control组比较,Model组细胞存活率显著下降(P<0.01);与Model组比较,AS-IV显著提高缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞存活率(P<0.01),而Beclin1-/-组细胞存活率较Model组进一步下降(P<0.01),AS-IV+Beclin1-/-组细胞存活率与Model组比较无显著差异;与AS-IV组比较,AS-IV+Beclin1-/-组细胞存活率显著下降(P<0.01);与Beclin1-/-组比较,AS-IV+Beclin1-/-组细胞存活率显著升高(P<0.01)。(2)LDH漏出率:与Control组比较,Model组细胞LDH漏出率显著提高(P<0.01);与Model组比较,AS-IV组和AS-IV+Beclin1-/-组细胞LDH漏出率均显著降低(P<0.05),Beclin1-/-组细胞LDH漏出率显著升高(P<0.01);与AS-IV组比较,AS-IV+Beclin1-/-组细胞LDH漏出率显著升高(P<0.01);与Beclin1-/-组比较,AS-IV+Beclin1-/-组细胞LDH漏出率显著降低(P<0.01)。(3)Caspase-3表达:Western Blot检测结果显示,与Control组比较,Model组细胞Caspase-3表达显著升高(P<0.01);与Model组比较,AS-IV组细胞Caspase-3表达显著下降(P<0.01),Beclin1-/-组细胞Caspase-3表达显著升高,AS-IV+Beclin1-/-组细胞Caspase-3表达与Model组比较无显著差异;与AS-IV组比较,AS-IV+Beclin1-/-组细胞Caspase-3表达显著升高(P<0.01);与Beclin1-/-组比较,AS-IV+Beclin1-/-组细胞Caspase-3表达显著降低(P<0.01)。小结:1.黄芪甲苷可显著提高MCAO/R大鼠脑组织和OGD/R HT22细胞Beclin1表达、提高LC3II/LC3I、降低P62表达,增加OGD/R HT22细胞自噬小体数量,有效提高MCAO/R大鼠和OGD/R HT22细胞自噬水平;同时,黄芪甲苷可提高OGD/R HT22细胞存活率,降低LDH漏出率,下调细胞内Bax/Bcl-2、Caspase-3水平及细胞凋亡率,对OGD/R HT22细胞发挥保护作用。表明黄芪甲苷可通过激活自噬发挥对脑I/R损伤的神经保护作用。2.对沉默Beclin1基因后的OGD/R HT22细胞,黄芪甲苷提高OGD/R细胞存活率、降低LDH漏出率和Caspase-3水平的作用被显著抑制。进一步证明黄芪甲苷可通过激活自噬发挥对脑I/R损伤的神经保护作用。第三部分黄芪甲苷通过AMPK/DDiT4/mTOR信号通路激活自噬抗缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞损伤的机制研究目的:通过OGD/R HT22细胞模型观察黄芪甲苷对AMPK/DDiT4/mTOR信号通路的影响,探讨黄芪甲苷是否通过AMPK/DDiT4/mTOR信号通路调控自噬发挥对脑I/R损伤的神经保护作用。方法:建立OGD/R细胞模型,将细胞随机分为正常对照组(Control),模型组(Model),黄芪甲苷组(AS-IV)(100μmol/L),黄芪甲苷+AMPK抑制剂组(AS-IV+Compound C),AMPK抑制剂组(Compound C)(10μmol/L)和AMPK激活剂组(AICAR)(1mmol/L)。通过Western Blot检测p-AMPK、AMPK、DDiT4、p-mTOR及mTOR蛋白表达,CCK-8法检测缺氧缺糖/复氧复糖细胞存活率,LDH法检测缺氧缺糖/复氧复糖细胞LDH漏出率。结果:(1)p-AMPK/AMPK、DDiT4及p-mTOR/mTOR表达:Western Blot检测结果显示:与Control组比较,Model组细胞p-AMPK/AMPK及DDiT4表达显著升高(P<0.01),p-mTOR/mTOR显著降低(P<0.01)。与Model组比较,AS-IV组和AICAR组p-AMPK/AMPK及DDiT4表达显著升高(P<0.01),p-mTOR/mTOR显著降低(P<0.01);AS-IV+Compound C组p-AMPK/AMPK、DDiT4及p-mTOR/mTOR表达显著降低(P<0.05);Compound C组p-AMPK/AMPK及DDiT4表达显著降低(P<0.05),p-mTOR/mTOR显著升高(P<0.01)。与AS-IV组比较,AS-IV+Compound C组与Compound C组细胞p-AMPK/AMPK及DDiT4表达显著降低(P<0.01),p-mTOR/mTOR显著升高(P<0.01);AICAR组细胞p-AMPK/AMPK及DDiT4表达显著升高(P<0.05)。(2)细胞存活率:CCK-8检测结果显示:与Control组比较,Model组细胞存活率显著降低(P<0.01);与Model组比较,AS-IV组、AS-IV+Compound C组和AICAR组细胞存活率显著提高(P<0.05),Compound C组细胞存活率与Model组比较无显著差别;与AS-IV组比较,AS-IV+Compound C组、Compound C组与AICAR组细胞存活率显著下降(P<0.01)。(3)LDH漏出率:LDH检测结果显示:与Control组比较,Model组细胞LDH漏出率显著升高(P<0.01);与Model组比较,AS-IV组、AS-IV+Compound C组和AICAR组细胞LDH漏出率均显著下降(P<0.01),Compound C组细胞LDH漏出率显著升高(P<0.01);与AS-IV组比较,AS-IV+Compound C组、Compound C组与AICAR组细胞LDH漏出率显著升高(P<0.01)。小结:黄芪甲苷可提高OGD/R HT22细胞p-AMPK/AMPK及DDiT4的表达、降低p-mTOR/mTOR,提高OGD/R HT22细胞存活率、降低LDH漏出率,表明黄芪甲苷可通过AMPK/DDiT4/mTOR信号通路激活自噬发挥对OGD/R HT22细胞的保护作用。结论:1.黄芪甲苷能够降低MCAO/R大鼠神经功能学评分、改善神经功能缺损症状、缩小脑梗死体积、抑制细胞凋亡、减轻神经元损伤程度;同时黄芪甲苷能够提高OGD/R HT22细胞存活率、降低LDH漏出率、减轻细胞凋亡程度,对脑I/R损伤发挥神经保护作用。2.黄芪甲苷可提高MCAO/R大鼠脑组织和OGD/R HT22细胞Beclin1表达及LC3II/LC3I、降低P62蛋白表达,增加OGD/R HT22细胞自噬小体数量,有效提高MCAO/R大鼠和OGD/R HT22细胞自噬水平;同时可提高OGD/R HT22细胞存活率,降低LDH漏出率,降低Bax/Bcl-2、Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡率;对沉默Beclin1基因后的OGD/R HT22细胞,黄芪甲苷提高OGD/R细胞存活率、降低LDH漏出率和Caspase-3水平的作用被显著抑制。表明黄芪甲苷可通过激活细胞自噬对脑I/R损伤发挥神经保护作用。3.黄芪甲苷可提高OGD/R HT22细胞内p-AMPK/AMPK及DDiT4表达,抑制p-mTOR/mTOR,激活AMPK/DDiT4/mTOR自噬信号通路,并可通过AMPK/DDiT4/mTOR信号通路激活自噬发挥对OGD/R HT22细胞的保护作用。