目的1.基于网络药理学方法进行加味肾气丸治疗肾性水肿药物作用靶点和通路的研究,探讨加味肾气丸治疗肾性水肿的作用机制。2.以加味肾气丸及其拆方为受试药物进行其对肾阳虚水肿模型大鼠影响的研究,以期为“温阳利水”方剂配伍法则的科学内涵提供实验数据支持。方法1.采用 TCMSP数据库筛选加味肾气丸潜在活性成分;采用Swiss Target Prediction和TCMSP数据库筛选加味肾气丸潜在活性成分的作用靶点;通过 OMIM、Gene Cards、Drug Bank、Pubmed数据库筛选肾性水肿的相关作用靶点,交叉比对加味肾气丸与肾性水肿的共同作用靶点;使用Cytoscape软件构建“成分-靶点”网络,使用 Network Analyzer插件进行参数分析;通过String数据库和Cytoscape软件建立PPI网络;通过DAVID数据库对靶点进行GO分析和KEGG通路分析。2.实验选取SPF级雄性健康SD大鼠,将70只大鼠随机分为空白组、模型组、原方组、温阳利水组、益肾利水组、益肾温阳组、利水组,每组 10只。采用氢化可的松联合阿霉素的方式复制肾阳虚水肿模型,造模后各给药组按相应剂量连续灌胃给药 14天。观察大鼠一般状态,记录大鼠肛温、体重和24 h尿量,检测各组大鼠24 h尿蛋白含量和生化指标水平,HE染色法观察大鼠肾组织形态学变化,ELIS A法检测大鼠肾阳虚相关指标和炎症因子指标水平,免疫组化法检测大鼠肾组织中IL-17的表达,Western blot法检测大鼠肾组织中AQP2、V2R蛋白和MAPK信号通路相关蛋白的表达。结果1.理论研究:依据网络药理学研究,共筛选得到加味肾气丸潜在活性成分1 1 1个,涉及1 20个作用靶点,筛选得到肾性水肿相关作用靶点1794个,交叉比对得到94个共有靶点。基于PPI网络筛选出93个效应靶点,通过GO分析和KEGG通路分析,发现生物过程涉及炎症反应、蛋白质水解作用、氧化还原反应、免疫反应等方面,信号通路涉及MAPK信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路等。结合相关文献,我们推测IL-17/MAPK通路可能是加味肾气丸干预肾性水肿的重要环节。2.实验研究:(1)对大鼠一般状态的影响:各给药组能一定程度改善肾阳虚水肿模型大鼠一般状态、各时间段体重、肛温及 24 h尿量,降低24 h尿蛋白水平。给药第14天,原方组大鼠体重明显高于利水组,24 h尿蛋白水平明显低于利水组、益肾温阳组。(2)肾组织形态学观察:各给药组能一定程度改善肾阳虚水肿模型大鼠肾组织病理损伤程度。(3)生化指标结果:各给药组能不同程度升高肾阳虚水肿模型大鼠血清TP和ALB水平,显著降低血清Crea和BUN水平。(4)肾阳虚相关指标结果:除利水组其余各给药组能一定程度提高肾阳虚水肿模型大鼠血清cAMP和cAMP/cGMP比值水平,降低血清cGMP水平,显著提高大鼠血清CRH、ATCH和Cor水平。(5)ELIS A法检测结果:各给药组能显著降低肾阳虚水肿模型大鼠血清AVP、IL-1β、IL-6和TGF-β1水平。原方组、温阳利水组大鼠血清IL-1β、IL-6和TGF-β1水平显著低于利水组;原方组大鼠血清IL-1β、IL-6水平显著低于益肾温阳组,原方组、温阳利水组大鼠血清TGF-β 1水平显著低于益肾温阳组。(6)免疫组化实验结果:原方组、温阳利水组、益肾利水组能显著降低肾阳虚水肿模型大鼠肾组织IL-17的表达水平。(7)Western blot 实验结果:①原方组、温阳利水组、益肾利水组能显著降低肾阳虚水肿模型大鼠肾组织AQP2、V2R蛋白表达水平。原方组大鼠肾组织AQP2蛋白表达水平明显低于益肾利水组、温阳利水组,V2R蛋白表达水平明显低于益肾利水组。②各给药组对肾阳虚水肿模型大鼠肾组织p38、ERK1/2蛋白表达水平均无影响,原方组、温阳利水组、益肾利水组能显著降低肾阳虚水肿模型大鼠肾组织p-p38、p-ERK1/2水平。原方组大鼠肾组织p-p38水平明显低于益肾利水组,p-ERK1/2水平明显低于益肾利水组、温阳利水组。结论1.加味肾气丸原方组及各拆方组对肾阳虚水肿模型大鼠有明显的治疗作用,且以原方组治疗效果更佳,提示本实验条件下,该方剂体现了“温阳利水”配伍法则的正确指导意义。2.加味肾气丸可通过多成分、多靶点、多途径发挥“温阳利水”作用,其发挥“温阳利水”作用的主要途径可能是:一是通过下调肾组织IL-17的表达,阻断MAPK信号通路,从而保护肾脏;二是通过抑制AVP表达,下调AQP2蛋白的表达,改善机体水液代谢紊乱。