论文部分内容阅读
目的:氧化应激诱导心肌细胞凋亡是放射性心脏病(RIHD)主要的发病机制,最终会导致心力衰竭,但目前,针对RIHD的治疗,并无特效药物,多是对症治疗,当出现心力衰竭时,有效的治疗方法就是心脏移植。抑制氧化应激反应可以防止心肌细胞凋亡,对RIHD起到保护作用。丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)具有抗氧化应激的作用,因此,培养H9c2心肌细胞,建立X射线损伤模型,从细胞水平探讨STS对H9c2心肌细胞辐射损伤的保护作用及相关机制,为RIHD的防治提供新的途径。方法:(1)X射线诱导H9c2细胞凋亡用含10%FBS的DMEM F12培养基培养细胞,将细胞分为5组:1空白对照组(Con)22Gy组34Gy组46Gy组58Gy组,分别照射相应剂量的X射线。MTT法测定细胞存活率,比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)水平,细胞平板克隆,Hochest33258荧光染色,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布,Western blot检测细胞中凋亡蛋白及p38MAPK信号通路蛋白表达水平。(2)STS对放射性心肌细胞损伤的保护作用用含10%FBS的DMEM F12培养基培养细胞,MTT法测定STS作用浓度,然后将细胞分为5组:1空白对照组(Con):无X射线照射,无STS22Gy+STS(2STS)组:用10μg/m L的STS预先处理细胞,然后照射2Gy的X射线34Gy+STS(4STS)组:用10μg/m L的STS预先处理细胞,然后照射4Gy的X射线46Gy+STS(6STS)组:用10μg/m L的STS预先处理细胞,然后照射6Gy的X射线58Gy+STS(8STS)组:用10μg/m L的STS预先处理细胞,然后照射8Gy的X射线。MTT法测定细胞存活率,比色法测定LDH、SOD以及MDA含量,细胞平板克隆,Hochest33258染色,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期,Western blot检测细胞中的蛋白表达水平。结果:(1)倒置相差显微镜细胞形态学观察:与空白对照组相比,单纯照射各组内细胞变圆或呈畸形,细胞数目明显减少;与相应剂量单纯照射组相比,STS预处理后细胞数目明显增多;与空白对照组相比,STS预处理各组细胞数目均减少,其中6STS、8STS组细胞数目减少明显。(2)MTT、LDH细胞活力检测:与Con相比,单纯照射组(4Gy、6Gy、8Gy)细胞存活率明显降低(P﹤0.05),LDH含量明显增高(P﹤0.05);与相应剂量单纯照射组相比,STS预处理组(4STS、6STS、8STS)细胞存活率增高(P﹤0.05),LDH含量明显降低(P﹤0.05);与Con组相比,STS预处理各组细胞存活率降低,其中8STS组细胞数目明显减少,具有统计学意义(P﹤0.05),LDH含量均增高,其中6STS、8STS组LDH含量增加具有统计学意义(P﹤0.05)。(3)氧化损伤相关酶检测:与Con相比,单纯照射各组SOD含量明显降低,MDA明显升高(P﹤0.05);与相应剂量单纯照射组相比,STS预处理各组SOD升高,MDA降低(P﹤0.05);与Con相比,STS预处理组(4STS、6STS、8STS)SOD含量降低,MDA含量升高(P﹤0.05)。(4)细胞平板克隆实验检测:与Con组相比,单纯照射各组克隆形成率均明显降低,且呈剂量依赖性(P<0.05);与相应剂量单纯照射组相比,STS预处理各组克隆形成率均明显增高(P<0.05),其中2STS组克隆形成率几乎恢复到空白组水平;与Con相比,除了2STS组,其它STS预处理组克隆形成率降低,差异具有显著性(P<0.05)。(5)Hochest33258细胞凋亡形态学检测:与Con组相比,单纯照射组细胞核凝聚显著增强,凋亡小体数目明显增多,尤其是8Gy组;与相应剂量单纯照射组相比,STS预处理组细胞核凝聚减轻,凋亡小体数目减少;与Con相比,STS预处理组细胞核凝聚增强,凋亡小体数目增多。(6)流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期:与Con组相比,单纯照射组(4Gy、6Gy、8Gy)细胞凋亡数目明显增多,G1期细胞比例逐渐增加,S期细胞比例显著降低(P<0.05);与相应剂量单纯照射组相比,STS预处理组细胞凋亡数目明显减少,G1期细胞比例降低,S期细胞比例增加(P<0.05);与Con相比,STS预处理组(6STS、8STS)细胞凋亡增加,G1期细胞比例增加,S期细胞比例降低(P<0.05)。(7)Western blot检测凋亡蛋白及P38-MAPK信号转导通路相关蛋白表达量:与Con组相比,单纯照射组(4Gy、6Gy、8Gy)Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白表达显著上调(P<0.05),P-P38、P-ERK蛋白表达显著下调(P<0.05);与相应剂量单纯照射组相比,STS预处理组Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白相对表达量显著下调(P<0.05),P-P38蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论:X射线通过氧化应激反应损伤H9c2心肌细胞,抑制其增殖,诱导细胞凋亡。STS能够减弱氧化应激反应,调节细胞周期分布,从而抑制心肌细胞凋亡。因此,STS可用于防治RIHD。