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研究背景:结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一,尽管手术切除原发或转移肿瘤是患者的最佳治疗,但多数结直肠癌患者手术不能达到完全根治。因此,放化疗在结直肠癌的治疗中有重要意义。各种实体瘤(如乳腺癌、胰腺癌、结肠癌等)内存在的肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)对现有放化疗方案抵抗。传统的化疗药物能够迅速分解肿瘤细胞,但不是肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的存在可能是肿瘤恶性生物学行为根本原因。细胞有丝分裂是真核生物生长的基础。非染色体结构维持蛋白I复合亚基D2(non-SMC condensing I complex subunit D2,NCAPD2)和非染色体结构维持蛋白Ⅱ复合亚基D3(non-SMC condensingⅡcomplex subunit D3,NCAPD3)在真核细胞有丝分裂过程中起着关键作用。前期,我们通过结直肠癌组织二代DNA测序发现,结直肠癌组织中NCAPD2和NCAPD3呈高表达状态。黄芩苷(Baicalin)是从中药黄芩中提取的黄酮类化合物,化学式为:C21H18011。前期研究表明,黄芩苷对错配修复基因hMLH1缺失的结肠癌HCT116细胞裸鼠原位移植瘤生长有明显抑制作用,其机制可能是黄芩苷促使肿瘤细胞G2/M期阻滞,诱导肿瘤细胞凋亡有关。目的:通过观察人结直肠癌组织和细胞中NCAPD2和NCPAD3的表达,探讨NCAPD2和NCAPD3与结直肠癌的发生、发展之间可能存在的关系;观察黄芩苷对体外培养的人结直肠癌RKO细胞、HCT116细胞、SW480细胞和HCT116干细胞的干性和NCAPD2/NCAPD3表达的影响,探寻黄芩苷抗肿瘤的作用机制,为临床靶向治疗结直肠肿瘤药物的研发提供理论依据和研究方向。方法:1.选用结直肠正常组织和肿瘤组织冰冻样本,进行二代DNA测序;选用相同标本,提取组织蛋白,Western blot检测正常组织和肿瘤组织中NCAPD2/NCAPD3的表达水平。2.选用结直肠正常组织、溃疡性结肠炎组织和结直肠肿瘤组织的蜡块样本,提取总RNA,使用qRT-PCR检测不同组织中NCAPD2/NCAPD3的基因表达。结合患者临床资料进行相关性分析。3.细胞培养和增殖。人正常结直肠上皮细胞FHC和三种不同分化程度的人结肠癌细胞RKO、HCT116、SW480置于37℃,5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养。当细胞生长到完全覆盖瓶底部之前,按照1:5的比例进行细胞传代,继续培养。4.取对数生长期细胞作为实验对象,用不同浓度(0、50、100、200)μg/ml的黄芩苷处理48小时后,Western bolt检测细胞中干性指标和NCAPD2/NCAPD3的表达水平。5.干细胞分选、培养和增殖。选用人结直肠癌细胞HCT116,采用无血清培养法分选HCT116干细胞,并按2000个/ml接种于干细胞培养基中,置于37℃,5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养。肿瘤球直径达100μm时,进行传代。6.干细胞干性鉴定。成球干细胞二次成球实验检测干细胞自我更新能力,Western blot对比分析HCT116干细胞和HCT116正常细胞干性指标(CD133、CD44、Nanog、OCT4和 SOX2)和 NCAPD2/NCAPD3 的蛋白表达水平。用RT-PCR 干性指标(CD133、CD44、Nanog、OCT4 和 SOX2)和NCAPD2/NCAPD3的基因表达。7.取成球干细胞,不同浓度(0、50、100、200)μg/ml的黄芩苷处理48h后,按1000个/孔接种于超低粘附六孔板中,观察干细胞成球能力。8.取成球干细胞,按2000个/孔接种于六孔板中,不同浓度(0、50、100、200)μg/ml的黄芩苷处理48小时后,Western blot检测干细胞干性指标(CD133、CD44、Nanog、OCT4 和 SOX2)和 NCAPD2/NCAPD3 的蛋白表达水平。9.统计学处理,使用SPSS21.0统计软件,各指标均以M±SD表示,两样本均数比较采用t检验,各组间比较采用单因素方差分析,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1.组织二代DNA测序结果显示,结肠癌组织中NCAPD2和NCAPD3的表达高于正常组织。Western blot检测显示结直肠癌组织NCAPD2和NCAPD3表达高于正常结直肠组织(P<0.01);2.QRT-PCR检测显示溃疡性结肠炎组织NCAPD2/NCAPD3的基因表达明显高于正常组织(P<0.01),结直肠癌组织NCAPD2表达高于正常组织,但差异无统计学意义(P=0.152),结直肠癌组织NCAPD3的表达高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.05);3.QRT-PCR检测结果结合患者临床资料分析显示,在性别方面女性结直肠癌患者NCAPD3表达高于正常女性患者;男性患者与女性患者NCAPD2和NCAPD3表达无明显差异(P>0.05);在患者年龄、淋巴结转移、肿瘤组织T分期、肿瘤分化和肿瘤组织类型上,NCAPD2和NCAPD3表达无明显差异(P>0.05)。4.细胞水平,与FHC相比,RKO、HCT116细胞中NCAPD2/NCAPD3的表达水平均较高,差异有统计学意义(P<0.01);SW480细胞NCAPD2/NCAPD3的表达与FHC无明显差异(P>0.05)。HCT116干细胞NCAPD2/NCAPD3的蛋白和基因表达明显低于HCT116正常细胞(P<0.01)。5.在不同浓度的黄苓苷处理三组细胞后,黄苓苷50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml组细胞干性指标和NCAPD2/NCAPD3的蛋白表达低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),并随着给药浓度的升高而呈下降趋势。6.黄岑苷干预HCT116干细胞后,干细胞二次成球能力下降,差异有统计学意义(P<0.05)。黄芩苷50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml组干细胞干性指标和NCAPD2/NCAPD3的蛋白表达低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),并随着给药浓度的升高而呈下降趋势。结论:1.NCAPD2和NCAPD3在溃疡性结肠炎和结直肠癌组织呈高表达,NCAPD2和NCAPD3可能与结直肠癌的发生和发展有关。2.黄芩苷能够抑制结直肠癌细胞的干性和NCAPD2和NCAPD3的表达,并呈一定的浓度依赖。3.黄芩苷能够抑制结直肠癌HCT116干细胞干性和NCAPD2和NCAPD3的表达,呈一定的浓度依赖。4.黄芩苷能够抑制结直肠癌HCT116干细胞干性,其作用可能与黄芩苷抑制干细胞NCAPD2和NCAPD3的表达有关。