论文部分内容阅读
目的:1. 检测小鼠肝缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤体外模型中Micro RNA-148a（miR-148a）、钙离子/钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅱα(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IIα,CAMKⅡα)以及下游炎性因子的表达情况,明确miR-148a与CAMKⅡα在该模型中的差异表达,以及两者之间的表达水平存在相关性。2.在小鼠肝I/R损伤模型中观察miR-148a与CAMKⅡα对肝脏损伤的影响,明确两者的免疫调控功能。3.探讨miR-148a缓解肝I/R损伤的分子机制,明确miR-148a对CAMKⅡα的靶向作用。方法:1. 使用Kupffer细胞的经典替代细胞株RAW 264.7细胞,使用免疫荧光检测其纯度与活性。建立小鼠肝I/R损伤经典体外模型,亦即细胞缺氧复氧模型（hypoxia/reoxygenation,H/R）。使用实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）评估miR-148a、CAMKⅡα、白介素（Interleukin,IL）-6、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）-α与IL-1β的表达水平,筛选最佳H/R时间组合以便后续实验。使用Western blot检测CAMKⅡα、干扰素调节因子（Interferon regulatory factor,IRF）3、p-IRF3、转化生长因子β-活化激酶（Transforming growth factor-β-activated kinase,TAK）1、p-TAK1、NF-κB抑制剂（inhibitor of NF-κB,IκB）α、p-IκBα和IL-1β在细胞H/R中的蛋白表达水平。2. 建立小鼠肝I/R损伤模型,检测miR-148a在肝脏中的表达。使用miR-148a的体内模拟物（agomir）、体内抑制剂（antagomir）以及CAMKⅡαsi RNA转染小鼠肝脏。使用HE染色评估小鼠肝脏I/R病理损伤情况,使用ELISA检测小鼠血清中IL-6、TNF-α与IL-1β的表达水平,使用微板法检测小鼠血清中ALT、AST的水平。3.分别使用miR-148a体外模拟物（mimic）与抑制剂（inhibitor）,CAMKⅡα、IRF3和TAK1的si RNA调控miR-148a、CAMKⅡα、IRF3和TAK1在细胞中的表达水平。使用Western blot检测CAMKⅡα、IRF3、p-IRF3、TAK1、p-TAK1的蛋白表达,使用ELISA检测细胞上清液中IL-6、TNF-α与IL-1β的表达水平。使用双荧光素酶报告基因实验明确miR-148a与CAMKⅡα的靶向关系。结果:1.在细胞H/R模型中,miR-148a显著下调（p<0.05）,而TNF-α（p<0.01）、CAMKⅡα、IL-6与IL-1β（p<0.05）的m RNA水平显著升高。缺氧6小时,复氧12小时被筛选为最佳H/R时间组合。miR-148a与CAMKⅡα的表达水平呈负相关。同时,CAMKⅡα、p-IRF3、p-TAK1、p-IκBα和IL-1β的蛋白表达在细胞H/R模型中显著上调（p<0.05）。2.随着再灌注时间延长,miR-148a水平逐渐下调,缺血1小时/再灌注9小时被选为最佳I/R时间组合以供后续实验。miR-148a的agomir能够显著改善小鼠肝I/R损伤后的肝脏病理损伤,antagomir则显著加剧了肝脏病理改变,NC组与sham组则无显著差异。小鼠血清中的IL-6、TNF-α（p<0.001）、IL-1β（p<0.01）、ALT和AST（p<0.001）水平在肝I/R损伤后显著升高,而miR-148a的agomir能够显著抑制它们的表达水平。与此相反的是,miR-148a antagomir可以显著提高IL-6、TNF-α、IL-1β、ALT和AST在血清中的水平（p<0.05）。值得一提的是,CAMKⅡα的si RNA能够显著的逆转miR-148a antagomir所导致的肝脏损伤、炎性因子的生成与肝酶的释放。3. 在细胞H/R模型中,下调miR-148a可以提高CAMKⅡα、p-IRF3、p-TAK1（p<0.05）的蛋白表达,在此基础上干扰CAMKⅡα后,CAMKⅡα、IRF3、TAK1受到抑制。同时干扰IRF3与TAK1后,CAMKⅡα的表达不受影响。最后,双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-148a模拟物能够显著抑制野生型（WT）CAMKⅡα的荧光素酶活性（p<0.01）,而对突变型（MUT）CAMKⅡα无明显影响。结论:1.miR-148a在肝I/R损伤中显著低表达,而CAMKⅡα及下游炎性蛋白显著高表达,二者表达水平负相关。2.过表达miR-148a能够显著改善小鼠肝I/R损伤,降低炎性因子的释放。下调miR-148a则加剧了肝脏损伤与肝功能的破坏。而干扰CAMKⅡα可以显著逆转miR-148a抑制剂的作用,表明miR-148a是小鼠肝缺血再灌注损伤中的保护性因子,其对肝脏免疫的调节可能源于对CAMKⅡα的调控。3. miR-148a在肝I/R损伤中的作用源于其对CAMKⅡα的调控,且下游的炎性信号转导包含了IRF3与TAK1的共同激活。在肝I/R损伤体外模型中干扰CAMKⅡα后,IRF3与TAK1的活化受到抑制。而同时干扰IRF3与TAK1后,对CAMKⅡα无显著影响,表明IRF3与TAK1的活化参与了CAMKⅡα介导的的炎性免疫应答。双荧光素酶报告基因实验结果表明,CAMKⅡα是miR-148a的直接靶点。综上所述,miR-148a在肝缺血再灌注中通过靶向CAMKⅡα,抑制下游IRF3和TAK1炎性信号的激活,最终缓解肝缺血再灌注损伤。miR-148a是治疗肝缺血再灌注损伤的潜在靶点。本研究为临床肝缺血再灌注损伤的诊疗、肝移植急性排斥反应的预防提供了研究基础与思路。