【摘 要】
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目的:对同时耐替加环素、多粘菌素且具有高黏表型的ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)KP18-29 的耐药组及毒力特征进行深入
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目的:对同时耐替加环素、多粘菌素且具有高黏表型的ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)KP18-29 的耐药组及毒力特征进行深入研究,阐明其产生广泛耐药及毒力的分子机制。方法:(1)采用微量肉汤稀释法和琼脂稀释法测定临床治疗肠杆菌科细菌感染常用的18种抗菌药物对KP18-29的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC);(2)基于 Illumina Miseq 和 PacBio RSII 平台对 KP18-29进行全基因组测序,分析KP18-29的耐药组及携带的毒力基因;(3)拉丝实验确定KP18-29的高黏性表型;基于小鼠脓毒症模型评价KP18-29的高毒力表型;(4)接合转移实验确定KP18-29携带的mcr-8.2基因的可转移性及其介导多粘菌素耐药的功能。(4)初步探索MCR-8.2蛋白的催化功能,对MCR-8.2蛋白催化结构域进行表达和纯化。结果:(1)肺炎克雷伯菌KP18-29仅对磷霉素敏感,对包括多粘菌素和替加环素在内的所有其他检测药物均耐药,具有广泛耐药表型。拉丝实验阳性结果表明KP18-29具有高黏表型。(2)全基因组测序结果显示KP18-29的MLST分型为ST11,血清型为K60;KP18-29包含一个5,360,130bp的染色体和4个大小分别为278,636bp,91,072bp,64,394bp,44,148bp质粒,基因组和质粒共携带包括mcr-8.2、tet(A)基因变异体和blaNDM-1在内的30个耐药基因。(3)携带mcr-8.2基因的质粒p18-29mcr-8.2为接合型质粒,序列分析发现该质粒可能是由来源于pMCR8095845-like质粒的包含mcr-8.2基因的片段与携带tra-trb功能区的接合型质粒pKpGoe414-3发生同源重组而形成的。(4)KP18-29不携带pLVPK-like毒力质粒和ICEKp元件,其染色体上存在81个假定的毒力相关基因,其中entB,fimABCDEFGHIK,iroE和mrkABCDFHIJ是肺炎克雷伯菌保守的毒力基因。小鼠脓毒症模型结果显示,不携带毒力质粒的高黏性肺炎克雷伯菌KP18-29的毒力弱于pLVPK-like毒力质粒携带株,但较之非高黏性经典肺炎克雷伯菌表现为毒力增强;(5)在部分片段Star表达菌株的沉淀中检测到MCR-8.2目的蛋白片段,但在洗脱液中并未发现目的蛋白。结论:通过对一株同时耐多粘菌素和替加环素且具有广泛耐药和高黏性表型的ST11型CRKP的研究解析,首次发现mcr-8.2基因由新型接合型质粒携带,并出现在国内流行的ST11克隆,表明mcr-8.2基因发生了进一步传播,导致了广泛耐药克隆的出现。因此,需对mcr-8.2基因在CRKP中的传播、流行加强监控。
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