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海水养殖向高密度、集约化发展的同时,鱼类病害问题日益突出。其中弧菌病害是危害海水养殖鱼类最严重的细菌病害之一,许多弧菌可感染多种鱼类并造成大量死亡,本文主要对山东地区海水养殖场分离的致病弧菌进行了以下几方面的研究: 从自然发病大菱鲆体内分离到病原菌TL01,经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为鳗弧菌;对从自然发病的鲈鱼、大菱鲆体内分离的病原鳗弧菌W-1、TL01及哈维氏弧菌SF-1的致病性研究表明,鳗弧菌W-1、TL01对牙鲆、大菱鲆有较强的致病性。W-1对牙鲆和大菱鲆腹腔感染的半数致死量LD50分别是2.06×104cfu/g和3.04×103cfu/g;TL01对牙鲆和大菱鲆腹腔感染的半数致死量LD50分别是5.09×104cfu/g和2.32×101cfu/g;哈维氏弧菌SF-1对牙鲆和大菱鲆腹腔感染的半数致死量LD50分别是9.65×103cfu/g和8.63×102cfu/g。 进行了鳗弧菌TL01、W-1抗血清制备,血清学实验表明,鳗弧菌W-1和TL01都属于O2血清型,哈维氏弧菌SF-1与鳗弧菌各血清型菌株之间无明显交叉反应。 对13株弧菌属的不同种的菌株、10个不同血清型的鳗弧菌标准菌株、9株哈维氏弧菌和4株副溶血弧菌的标准菌株的外膜蛋白分别提取并进行了分析;结果表明13株弧菌属的不同种的菌株外膜蛋白的SDS-PAGE图谱各不相同。不同菌种间主要的外膜蛋白有较大差异,一般有4-5条,分子量范围为25kD~70kD。 10种血清型的鳗弧菌的主要外膜蛋白的图谱各不相同。每个血清型的鳗弧菌标准菌株外膜蛋白有2-6条,分子量主要在25kD-70kD之间,但所有鳗弧菌均有1~2条主要外膜蛋白,分子量界于40kD和55kD之间,且在大部分菌株中其中一条的分子量在40kD左右。从当地分离的病原菌W-1和TL01最主要的外膜蛋白为40kD左右,另外还各有一条主要外膜蛋白带,分子量分别为53kD和44kD左右。 哈维氏弧菌菌株之间主要外膜蛋白的分子量相差比较大,没发现有各菌株间共同的主要蛋白,主要外膜蛋白有3-6条,分子量集中在30-48kD的区域。副溶血弧菌几株菌的外膜蛋白图谱总体比较相似,条带数比较多,一般多于3-5条,主中国梅洋大学硕士研究生论文要外膜蛋白分子量界于30kD一okD。 研究了不同培养基和培养条件对弧菌对外膜蛋白表达的影响,结果表明在缺铁基础培养基CMg中37℃条件下鳗弧菌W一1、TL01表达了一条分子量较小的主要外膜蛋白,分子量为35kD左右。 用SePhadex一G100、头phaeryl 5100凝胶层析和DEAE.SePharose Fast Flow、DEAE一纤维素层析对鳗弧菌W一1和TL01的主要外膜蛋白进行了分离,均未取得理想的分离效果。最后采用SDS-PAGE电泳分离后,直接在凝胶上切下目的蛋白,得到了电泳纯的鳗弧菌主要外膜蛋白,其分子量为35kD。 用鳗弧菌外膜蛋白以注射接种的方式对海水养殖大菱虾鱼苗进行免疫,4周后检测血清中特异性抗体,然后用鳗弧菌悬液(3 .7xl了cfu/ml)0.2ml腹腔注射感染免疫鱼,结果表明用鳗弧菌外膜蛋白免疫后能刺激大菱虾产生特异性免疫反应,免疫4周人工感染后的免疫保护力为45.45%。