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目的:随着工业化进程的发展,世界上7%的男性患有不育症,使其成为公共关注的焦点,男性不育症的影响因素是多方面的,环境污染是重要的影响因素之一。引起生殖系统损伤的环境污染物种类复杂多样,重金属则是其中之一。锰（Manganese,Mn）作为重金属的一种,是人体必须的微量元素,参与人体的多种功能活动。但环境中过量的锰暴露也会对雄性生殖系统产生影响,已有研究表明,锰可通过血睾屏障而蓄积于睾丸,从而损害雄性生殖系统。精子发生是哺乳动物睾丸中贯穿一生每天产生数以亿计精子的基础。其包含精原干细胞的自我更新、精原细胞的有丝分裂、精母细胞的减数分裂以及精子变形这四个阶段,任何环节的失调都将导致精子发生障碍。细胞周期各个阶段交替变化可精确的调控精子发生过程,其细胞周期蛋白B1（CCNB1）和细胞周期蛋白B2（CCNB2）为调节亚基,推动细胞周期各时相的有序进行。生精功能障碍是男性不育的一个关键因素,从不同层面探究精子发生中的调控机制对于有效防治男性不育具有重要意义。m6A识别蛋白YTHDC2对于小鼠精子发生不可或缺,但其在精子发生中的功能和作用机制尚不清楚。因此,本研究探讨m6A识别蛋白YTHDC2在锰致精子发生障碍中的作用机制,为进一步研究锰对雄性生殖系统的毒理机制提供理论依据。研究方法:1.本研究首先取接触Mn作业男工28名和非Mn接触对照男工31名精浆检测其精子质量,并用ICP-MS检测精浆中锰含量,用Real-time RT-PCR检测精浆中YTHDC2、CCNB1和CCNB2的mRNA表达。2.动物实验采用3～4周雄性昆明小鼠32只（25±2g）,随机均匀分为4组。分别为对、低、中、高剂量染锰组,各组小鼠腹腔分别注射生理盐水、12.5 mg/kg MnCl2、25 mg/kg MnCl2和50mg/kg MnCl2,每日染毒一次,持续2周,继续喂养35天后处死取睾丸。分离附睾显微镜下观察精子数目和精子形态。取睾丸组织制备石蜡切片,HE染色观察睾丸组织形态及生精情况。取小鼠睾丸组织RNA和蛋白质,用于YTHDC2、CCNB1和CCNB2 mRNA表达和蛋白水平的检测。3.细胞实验采用精原细胞（GC-1 spg）细胞,经终浓度为0μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L的MnCl2处理24h后,使用倒置显微镜观察各剂量组细胞形态及CCK8检测细胞活力。提取GC-1 spg细胞RNA和蛋白质,用于YTHDC2、CCNB1和CCNB2 mRNA表达和蛋白水平的检测。采用流式细胞仪检测染锰后GC-1 spg细胞的细胞周期。采用脂质体转染的方法构建YTHDC2过表达的GC-1 spg细胞,同时以GFP标记的空载脂质体转染为阴性对照,转染48小时后,用倒置荧光显微镜观察荧光强度并用Real-time RT-PCR和Western blotting检测YTHDC2的mRNA表达和蛋白水平,以评价细胞转染效率。在阴性对照细胞和YTHDC2过表达细胞中各设对照组和400μmol/L MnCl2组,分别提取各组细胞的RNA和蛋白质,用于检测CCNB1和CCNB2 mRNA表达和蛋白质水平。用流式细胞仪检测转染后GC-1 spg细胞的细胞周期。结果:1.与对照组相比,锰暴露组男工精子总数和精子浓度明显下降（P<0.05或P<0.01）,同时锰暴露组男工精子总活力（sperm total motility,PR+NP）%和前向运动力（progressive motility,PR）%明显下降（P<0.05或P<0.01）。精浆中Mn的含量显著升高（P<0.01）。精浆中YTHDC2的mRNA表达显著下降（P<0.05）。2.动物实验结果显示,与对照组相比,随着染锰剂量的增加,HE结果显示睾丸组织形态改变明显,官腔内成熟的精子数目明显减少,小鼠精子数目明显下降,精子畸形率显著上升。睾丸中YTHDC2的mRNA表达和蛋白质水平显著下降并呈现剂量依赖性的趋势。3.细胞实验结果显示,与对照组相比,随着染锰剂量的增加,GC-1 spg细胞皱缩变形,粘附力下降,细胞数目逐渐减少,同时细胞活力逐渐下降。YTHDC2的mRNA表达和蛋白质水平逐渐下降并呈现剂量依赖性的趋势。流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比,在200和400μmol/L MnCl2组中,S期细胞指数显著下降（P<0.01）,G2/M期细胞指数显著上升（P<0.01）,G0/G1期细胞指数未见明显改变。4.通过对Wojtas MN等人研究的数据库进行Pathway和Go分析,发现CCNB通路可能会是YTHDC2调控的下游分子,并发现GC-1 spg细胞、小鼠睾丸和人群精浆中,Mn可以致CCNB1和CCNB2下降。5.脂质体转染YTHDC2基因结果显示,免疫荧光检测转染效率达90%以上。流式细胞仪检测结果显示,与OE-NC组比较,OE-NC的400μmol/L MnCl2组和OE-YTHDC2的400μmol/L MnCl2组的细胞周期G2/M期细胞指数显著上升（P<0.01）;与OE-NC的400μmol/L MnCl2组比较,OE-YTHDC2的400μmol/L MnCl2组的细胞周期G2/M期细胞指数显著下降（P<0.01）。与OE-NC组比较,OE-NC的400μmol/L MnCl2组和OE-YTHDC2的400μmol/L MnCl2组CCNB1的mRNA表达和蛋白质水平显著下降,而OE-YTHDC2组CCNB2的mRNA表达和蛋白质水平显著上升（P<0.01）;与OE-NC的400μmol/L MnCl2组比较,OE-YTHDC2的400μmol/L MnCl2组CCNB1的mRNA表达和蛋白质水平无明显变化,而CCNB2的mRNA表达和蛋白水平显著上升（P<0.01）。结论:1职业锰暴露可导致男工精浆中锰含量升高,使精子浓度和精子总数下降进而造成精液质量差。2锰暴露可造成雄性小鼠生殖系统损伤,生精功能发生障碍。3锰可通过下调YTHDC2抑制CCNB2表达,使精原细胞周期阻滞于G2/M期,进而干扰精子发生过程。