日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）是世界主要对虾养殖品种之一,有着十分重要的经济价值。然而,随着对虾养殖产业的持续快速发展,疾病频发,养殖产业受到严重冲击。TLR/NF-κB信号通路是重要的先天性免疫通路,在对虾抵抗病毒性感染和细菌性感染中发挥着重要作用。本研究基于日本囊对虾转录组分析,围绕日本囊对虾TLR/NF-κB信号通路中的关键调控基因MjPellino及下游效应因子抗脂多糖因子MjALF-D,开展了相应序列和结构鉴定、组织特异性分布分析、免疫刺激诱导分析、蛋白功能验证及抗菌肽LBD区域的改造优化等研究,探究其抗细菌抗病毒的功能及免疫应答机制,获得了以下主要研究结果:1.日本囊对虾Pellino基因的鉴定及功能研究首先,本研究通过对日本囊对虾MjPellino基因的克隆及鉴定,得到日本囊对虾MjPellino基因的m RNA序列全长为2139 bp,包含一个长度为114-bp（1-114）的5’非翻译区（UTR）及一个长度为726-bp（1414-2139）的3’UTR,以及长度为1299-bp的ORF（115-1413）,共编码432个氨基酸。基于q RT-PCR对MjPellino m RNA进行组织表达分析,结果表明,MjPellino在日本囊对虾检测的的8个组织（鳃、肝胰腺、心脏、胃、血淋巴细胞、肠道、肌肉以及眼柄）中均有所表达,并在鳃中的表达量相对最高。在免疫刺激诱导实验中发现,经过WSSV、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、LPS以及Poly（I:C）的分别刺激,MjPellino m RNA的表达水平在日本囊对虾的鳃和血淋巴细胞中均呈现不同程度的上调现象。在蛋白水平上,本研究进一步对MjPellino的功能进行了分析,通过三维建模、蛋白质分子对接分析以及GST pull-down等发现MjPellino蛋白与WSSV的囊膜蛋白VP26相互结合;并且,在活体水平进行了RNA干扰实验,结果证实,MjPellino敲降后可以显著抑制MjALF-D等日本囊对虾抗菌肽的表达。这些结果揭示了MjPellino可能在日本囊对虾的免疫应答中起重要作用。有助于拓展对虾先天免疫应答的认知,并为对虾类应对不同病原体的免疫防御提供重要的基础信息。2.日本囊对虾MjALF-D基因的鉴定及免疫刺激分析通过对日本囊对虾MjALF-D基因的克隆及鉴定,得到MjALF-D c DNA序列全长为756 bp,ORF长为375 bp,编码124个氨基酸,其中包含有一个26个氨基酸组成的信号肽及一个脂多糖结合域（LBD）。通过蛋白结构分析发现MjALF-D由3个α-螺旋、4个β-折叠以及无规卷曲组成。通过q RT-PCR检测MjALF-D组织特异性,发现其主要集中在胃组织中表达;此外,经LPS、副溶血弧菌及WSSV的诱导刺激后,在日本囊对虾鳃和胃中MjALF-D m RNA表达水平均呈现不同程度的上调。预示其可能参与到日本囊对虾的天然免疫应答过程。3.日本囊对虾MjALF-D重组蛋白（rMjALF-D）的诱导表达纯化本研究成功构建了rMjALF-D的原核表达系统,并对其诱导表达条件及纯化工艺进行了优化,在IPTG终浓度为0.3 m M,且诱导温度为28℃时进行6 h的诱导可得到大量rMjALF-D,并通过蛋白印迹及质谱鉴定手段确证了所获rMjALF-D的正确性。4.日本囊对虾MjALF-D的抗菌活性及机制分析通过液体抑菌法对重组蛋白抗菌谱进行检测,表明rMjALF-D具有抗副溶血弧菌等细菌的活性,并且杀菌活性具有时间及浓度依赖性。通过扫描电镜（SEM）及透射电镜（TEM）观察发现,rMjALF-D能够引起菌体大量聚集,菌体间产生丝状或絮状物,最终导致细菌失去原有完整结构而破裂死亡;并且rMjALF-D能够与细菌及基因组DNA结合,并对其蛋白表达产生一定的影响。5.脂多糖结合域LBD短肽的改造设计合成与活性检测通过分析MjALF-D的LBD区域（LBD-ALF）的理化性质并以其为基础设计合成了三条全新的LBD改造短肽—LBD-K、LBD-Q、LBD-S。并通过体外抑菌试验分析评估其抑菌及杀菌活性,显示改造后的三条短肽均较原抗抗菌肽LBD活性有所提高,尤其是LBD-Q具有更为广谱的抗菌活性。因此选择LBD-Q进行后续的抗菌及抗病毒活性检测及杀菌机理分析。结果表明,LBD-Q的杀菌活性具有浓度以及时间依赖性,且通过SEM和TEM观察LBD-Q处理后的细菌结构发现其能够引起菌体聚集成团,形成大量黏性物质裹覆菌体,并最终引起菌体失去完整形状而破裂死亡。并且,LBD-Q被证明可以和细菌基因组DNA相互结合。此外,将LBD-Q与溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌及WSSV共孵后注射活体,可使得感染后的日本囊对虾存活率提高且WSSV复制降低,表明其发挥着重要抵抗细菌感染功能,并在对虾抵御WSSV感染中对机体能起到一定的保护作用。