【摘 要】
:
日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)是世界主要对虾养殖品种之一,有着十分重要的经济价值。然而,随着对虾养殖产业的持续快速发展,疾病频发,养殖产业受到严重冲击。TLR/NF-κB信号通路是重要的先天性免疫通路,在对虾抵抗病毒性感染和细菌性感染中发挥着重要作用。本研究基于日本囊对虾转录组分析,围绕日本囊对虾TLR/NF-κB信号通路中的关键调控基因MjPellino及下游效应因子
【基金项目】
:
十三五“蓝色粮仓科技创新”国家重点研发计划项目(项目编号:2019YFD0900803); 国家虾产业技术体系项目(Grant No. CARS-48);
论文部分内容阅读
日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)是世界主要对虾养殖品种之一,有着十分重要的经济价值。然而,随着对虾养殖产业的持续快速发展,疾病频发,养殖产业受到严重冲击。TLR/NF-κB信号通路是重要的先天性免疫通路,在对虾抵抗病毒性感染和细菌性感染中发挥着重要作用。本研究基于日本囊对虾转录组分析,围绕日本囊对虾TLR/NF-κB信号通路中的关键调控基因MjPellino及下游效应因子抗脂多糖因子MjALF-D,开展了相应序列和结构鉴定、组织特异性分布分析、免疫刺激诱导分析、蛋白功能验证及抗菌肽LBD区域的改造优化等研究,探究其抗细菌抗病毒的功能及免疫应答机制,获得了以下主要研究结果:1.日本囊对虾Pellino基因的鉴定及功能研究首先,本研究通过对日本囊对虾MjPellino基因的克隆及鉴定,得到日本囊对虾MjPellino基因的m RNA序列全长为2139 bp,包含一个长度为114-bp(1-114)的5’非翻译区(UTR)及一个长度为726-bp(1414-2139)的3’UTR,以及长度为1299-bp的ORF(115-1413),共编码432个氨基酸。基于q RT-PCR对MjPellino m RNA进行组织表达分析,结果表明,MjPellino在日本囊对虾检测的的8个组织(鳃、肝胰腺、心脏、胃、血淋巴细胞、肠道、肌肉以及眼柄)中均有所表达,并在鳃中的表达量相对最高。在免疫刺激诱导实验中发现,经过WSSV、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、LPS以及Poly(I:C)的分别刺激,MjPellino m RNA的表达水平在日本囊对虾的鳃和血淋巴细胞中均呈现不同程度的上调现象。在蛋白水平上,本研究进一步对MjPellino的功能进行了分析,通过三维建模、蛋白质分子对接分析以及GST pull-down等发现MjPellino蛋白与WSSV的囊膜蛋白VP26相互结合;并且,在活体水平进行了RNA干扰实验,结果证实,MjPellino敲降后可以显著抑制MjALF-D等日本囊对虾抗菌肽的表达。这些结果揭示了MjPellino可能在日本囊对虾的免疫应答中起重要作用。有助于拓展对虾先天免疫应答的认知,并为对虾类应对不同病原体的免疫防御提供重要的基础信息。2.日本囊对虾MjALF-D基因的鉴定及免疫刺激分析通过对日本囊对虾MjALF-D基因的克隆及鉴定,得到MjALF-D c DNA序列全长为756 bp,ORF长为375 bp,编码124个氨基酸,其中包含有一个26个氨基酸组成的信号肽及一个脂多糖结合域(LBD)。通过蛋白结构分析发现MjALF-D由3个α-螺旋、4个β-折叠以及无规卷曲组成。通过q RT-PCR检测MjALF-D组织特异性,发现其主要集中在胃组织中表达;此外,经LPS、副溶血弧菌及WSSV的诱导刺激后,在日本囊对虾鳃和胃中MjALF-D m RNA表达水平均呈现不同程度的上调。预示其可能参与到日本囊对虾的天然免疫应答过程。3.日本囊对虾MjALF-D重组蛋白(rMjALF-D)的诱导表达纯化本研究成功构建了rMjALF-D的原核表达系统,并对其诱导表达条件及纯化工艺进行了优化,在IPTG终浓度为0.3 m M,且诱导温度为28℃时进行6 h的诱导可得到大量rMjALF-D,并通过蛋白印迹及质谱鉴定手段确证了所获rMjALF-D的正确性。4.日本囊对虾MjALF-D的抗菌活性及机制分析通过液体抑菌法对重组蛋白抗菌谱进行检测,表明rMjALF-D具有抗副溶血弧菌等细菌的活性,并且杀菌活性具有时间及浓度依赖性。通过扫描电镜(SEM)及透射电镜(TEM)观察发现,rMjALF-D能够引起菌体大量聚集,菌体间产生丝状或絮状物,最终导致细菌失去原有完整结构而破裂死亡;并且rMjALF-D能够与细菌及基因组DNA结合,并对其蛋白表达产生一定的影响。5.脂多糖结合域LBD短肽的改造设计合成与活性检测通过分析MjALF-D的LBD区域(LBD-ALF)的理化性质并以其为基础设计合成了三条全新的LBD改造短肽—LBD-K、LBD-Q、LBD-S。并通过体外抑菌试验分析评估其抑菌及杀菌活性,显示改造后的三条短肽均较原抗抗菌肽LBD活性有所提高,尤其是LBD-Q具有更为广谱的抗菌活性。因此选择LBD-Q进行后续的抗菌及抗病毒活性检测及杀菌机理分析。结果表明,LBD-Q的杀菌活性具有浓度以及时间依赖性,且通过SEM和TEM观察LBD-Q处理后的细菌结构发现其能够引起菌体聚集成团,形成大量黏性物质裹覆菌体,并最终引起菌体失去完整形状而破裂死亡。并且,LBD-Q被证明可以和细菌基因组DNA相互结合。此外,将LBD-Q与溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌及WSSV共孵后注射活体,可使得感染后的日本囊对虾存活率提高且WSSV复制降低,表明其发挥着重要抵抗细菌感染功能,并在对虾抵御WSSV感染中对机体能起到一定的保护作用。
其他文献
在小鼠早期妊娠中,胚胎着床和蜕膜化是妊娠成功建立的两个关键事件。任何一个事件出现问题都可导致不孕、流产等严重后果。应激可使机体内糖皮质激素水平升高,从而引起许多生殖相关疾病,如早产、胎儿生长受限、流产和胎儿慢性疾病等。虽然过量的糖皮质激素不利于妊娠的相关研究很多,但是糖皮质激素对胚胎着床和蜕膜化影响的研究较少,特别是相关机制的研究更少。Hsd11b2可以使糖皮质激素失活,且在人和小鼠胎盘糖皮质激素
水禽作为禽流感病毒的天然宿主和主要传播源,在感染禽流感病毒后临床上并不表现出典型的流感症状。随着禽流感病毒流行病学研究的深入,发现原来只对陆生禽类产生高致病性的禽流感病毒,现在也出现部分对水禽产生高致病性的毒株。这些对水禽产生高致病性的禽流感病毒不仅可以在水禽体内的多个器官进行复制,还可以对水禽造成神经损伤,甚至死亡。导致这种现象出现的主要原因,病毒方面是其自身基因的不断变异使其逃逸宿主的免疫应答
金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜共患条件性致病菌,自畜禽相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(LA-MRSA)出现以来,动物源金黄色葡萄球菌引起人们的广泛关注。动物源金黄色葡萄球菌呈现多重耐药性,其耐药机制复杂多样。本研究调查了我国不同地区猪源和牛奶源金黄色葡萄球菌的分子流行病学特点,运用全基因组测序技术研究重要耐药基因的传播机制,分析了LA-MRSA的遗传进化特征。本研究在内蒙古、河南和重庆地区采集25
两系杂交稻作为水稻杂种优势利用的主要途径之一,是保障我国粮食安全的关键技术,它的成功应用主要得益于光温敏雄性核不育材料的研究与开发。因此,寻找更多来源不同的光温敏不育材料,深入挖掘其不育的分子机理,对揭示环境因子与水稻育性发育的调控机制和指导杂交育种工作具有重要意义。Sa是控制籼粳杂种雄性不育的复合座位,包含2个紧密相邻的互作基因SaF和Sa M。本研究在粳稻台中65(T65,含有无功能基因型Sa
中国是世界农业生产、消费和贸易大国,中国农产品市场的相对稳定,直接影响到农民收入增长和农业经济发展,关系到中国社会稳定和国民经济发展。2004年以后,中国农产品贸易逆差形成并持续扩大,大宗农产品从2009年以后已全面进入净进口贸易阶段,这已成为国内学者和政府高度关注的重要问题。加入WTO以后,中国与国际农产品市场的相互影响不断加深,正确认识中国农产品贸易逆差形成和扩大的根源,对于统筹利用国内国外两
A型流感病毒是重要的人兽共患病病原,其基因组由八个节段的单股负链RNA组成,可感染人、马、猪、犬、禽等多种动物。既对人类公共卫生安全构成了极大威胁,也给农业生产造成了不可估量的损失。而流感病毒的跨种间传播使其危害更加严重。目前为止,所有在人群中引起大流行的流感病毒均起源于流感病毒的跨种间传播。如1918年西班牙大流感病毒的基因组来源于禽流感病毒,而人2009年大流行H1N1流感病毒的基因组来源于人
自2013年开始的全国范围实施的新一轮农地确权,是中国农地制度的又一次重大改革,倍受学界关注与讨论。实践中的一个值得深究的制度创新实践是“先整合后确权”模式。该模式始于广东阳山和湖北沙洋等地,是在农地确权颁证之前,通过将细碎、分散的承包土地置换整合,实现“按户连片”。深入探究农地确权及农地整合确权模式的制度经济学含义具有重大意义。本文重点剖析农地确权政策实施中的三个问题:第一,一般农地确权模式实施
为了分析爆珠溶剂的主要化学成分,分别建立了辛癸酸甘油酯主要化学成分的气相色谱-氢火焰离子化(GC-FID)和高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)两种直接分析方法,测定了9种市售爆珠卷烟中爆珠溶剂辛癸酸甘油酯的组成,并比较了两种方法的性能。结果表明:(1)两种方法的检出限低、重复性高,在各自的测量浓度范围内均具有良好的线性相关性(R2>0.999),均适用于卷烟爆珠溶剂辛癸酸甘油酯中主要化
植物入侵不仅是一种自然现象,也与一个地区的社会经济发展和土地利用密切相关。在全球气候变暖的背景下,植物入侵对物种多样性和生态完整性造成了重大威胁。有效防治外来植物入侵,不仅要对外来植物的入侵力展开研究,还要对不同群落抵御入侵的潜在机制即群落的可入侵性(invasibility)进行深入的分析。研究群落的可入侵性可为防控植物入侵提供更全面的理论支撑,对揭示全球变化背景下区域生物多样性维持和稳定机制具
近年来,国家财政大力投入普惠金融发展建设,推行的效果并不理想,“农户惧贷,银行惜贷”的现象依旧普遍存在,尤其是小农更容易受到金融排斥。这引发了本文对农户为何难以获得正规金融贷款原因的思考。信息不对称及缺乏有效的合约机制,导致金融交易产生高昂的交易费用,使得农户借贷矛盾尖锐。在此背景下,本文运用交易费用理论,分析交易费用对农户正规借贷行为的影响,为降低银农合约签订的交易费用,建立低交易费用的普惠金融