论文部分内容阅读
郁金香(Tulipa L.)为百合科郁金香属球根花卉,在园艺产业中占重要地位。花色是决定郁金香观赏价值的重要因素。花色苷为郁金香花瓣的主要色素,获取花色苷合成相关基因的信息对郁金香花色分子育种具有重要意义。郁金香品种Tulipa fosteriana‘Albert heijn’(花瓣粉色)经多年芽变选育,获得新品种‘上农早霞’(花瓣红色)和突变株系‘上农09’(花瓣浅红),花色为三者主要表型差异,然而,花色变化的生化和分子基础尚不清楚。本文首次从郁金香花瓣中克隆了花色苷合成相关的9个结构基因和6个转录因子的c DNA全长,并从总花色苷和黄酮醇含量、花色苷组分、花色苷合成相关基因的表达和调控等方面,对‘Albert heijn’、‘上农早霞’和‘上农09’进行了分析比较,探讨这些因素与‘上农早霞’和‘上农09’花色变化的关系。主要研究结果如下:1.‘Albert heijn’、‘上农早霞’和‘上农09’在花色、花瓣总花色苷和黄酮醇类物质含量,以及花色苷组分方面存在显著差异。利用英国皇家园艺学会比色卡(RHSCC)对花色进行描述,结果显示,‘Albert heijn’花色属于“Red-purple”(红紫)色系,‘上农早霞’和‘上农09’花色分别属于“Red”(红)和“Orange-red”(橙红)色系。应用超高效液相色谱–二极管阵列器(ULPC-PDA)分析花瓣中总花色苷和黄酮醇类物质的含量,结果显示,花朵完全开放时,‘上农早霞’花瓣总花色苷含量显著高于‘Albert heijn’,但‘上农09’花瓣总花色苷含量与‘Albert heijn’无显著差异,‘上农早霞’和‘上农09’总黄酮醇类物质含量显著高于‘Albert heijn’中相应含量。应用超高效液相色谱–四极杆飞行时间质谱联用仪(UPLC-Q-TOF-MS)分析花瓣花色苷组分,结果表明,花朵完全开放时,‘Albert heijn’花瓣中含79.33%的矢车菊素3-O-芸香糖苷和20.67%的天竺葵素3-O-芸香糖苷,而‘上农早霞’和‘上农09’花瓣中含90%以上天竺葵素花色苷(天竺葵素3-O-芸香糖苷、天竺葵素3-O-乙酰化芸香糖苷)和少量矢车菊素3-O-葡萄糖苷含量(<10%)。2.利用同源克隆结合RACE技术,首次从郁金香花瓣中克隆了9个花色苷合成结构基因的c DNA全长,分别命名为Tf CHS1(1470 bp)、Tf CHI1(998 bp)、Tf CHI2(823 bp)、Tf F3H1(1241 bp)、Tf F3’H1(1766bp)、Tf DFR1(1394 bp)、Tf ANS1(1371 bp)、Tf3GT1(1673 bp)和Tf FLS1(1193 bp)。由这些基因推导的氨基酸序列与其它物种中相应蛋白具有很高的相似性,并具有相应蛋白中保守的结构域、氨基酸、结合位点及活性位点。3.花色苷合成结构基因在‘Albert heijn’、‘上农早霞’和‘上农09’花朵发育过程中的表达水平存在显著差异。与‘Albert heijn’相比,‘上农早霞’和‘上农09’花瓣中Tf CHS1、Tf CHI2、Tf F3H1、Tf DFR1、Tf ANS1、Tf FLS1和Tf F3’H1表达水平的变化与总花色苷和黄酮醇类物质含量以及矢车菊素含量的变化正相关。在花朵发育过程中,Tf CHS1、Tf CHI2、Tf F3H1、Tf DFR1、Tf ANS1和Tf3GT1表达水平持续上升,与花色苷积累模式一致,Tf FLS1表达量缓慢下降,与黄酮醇类物质的积累模式一致。‘上农早霞’花瓣中Tf CHS1、Tf CHI2、Tf F3H1、Tf DFR1、Tf ANS1和Tf FLS1表达量均显著高于‘Albert heijn’,与‘上农早霞’花瓣中更高的总花色苷和黄酮醇类物质含量相对应;‘上农09’花瓣中Tf CHS1、Tf CHI2、Tf F3H1和Tf FLS1的表达水平显著高于‘Albert heijn’,但Tf DFR1和Tf ANS1表达水平与‘Albert heijn’无显著差异,与‘上农09’花瓣中更高的总黄酮醇类物质含量相对应。‘上农早霞’和‘上农09’花瓣中Tf F3’H1的表达水平显著低于‘Albert heijn’,与两者花瓣中极低的矢车菊素含量相对应。4.分析了‘上农早霞’和‘上农09’Tf F3’H1基因表达受抑制的原因。比较‘Albert heijn’、‘上农早霞’和‘上农09’Tf F3’H1基因启动子序列,发现与‘Albert heijn’相比,‘上农早霞’和‘上农09’Tf F3’H1翻译起始位点上游326 bp处插入了一段255 bp的序列。将郁金香三种材料Tf F3’H1基因启动子序列与GUS基因相连,转化烟草叶片和拟南芥,发现转基因拟南芥幼苗中,‘上农早霞’和‘上农09’Tf F3’H1基因启动子活性仅分别为‘Albert heijn’的5.4%和4.5%,表明Tf F3’H1基因启动子的插入突变显著抵制了Tf F3’H1的表达水平。5.利用同源克隆结合RACE技术,同时基于郁金香花瓣转录组数据库,首次从郁金香花瓣中克隆了4条R2R3MYB和2条b HLH转录因子的c DNA全长,分别命名为Tf MYB1(856 bp)、Tf MYB2(840 bp)、Tf MYB3(906 bp)、Tf MYB4(851 bp)、Tfb HLH1(2527 bp)和Tfb HLH2(2321 bp),Tf MYBs与拟南芥PAP1和PAP2以及矮牵牛Ph AN2有很高的同源性,Tfb HLH1和Tfb HLH2与拟南芥At EGL3、At TT8、At GL3以及矮牵牛Ph AN1有很高的同源性。利用实时荧光定量PCR技术分析了花朵发育过程中这些基因在‘Albert heijn’、‘上农早霞’和‘上农09’花瓣中的表达模式,结果显示,Tf MYB2、Tf MYB3、Tf MYB4、Tfb HLH1在花朵发育过程中的表达模式与Tf CHS1、Tf CHI2、Tf F3H1、Tf DFR1、Tf ANS1和Tf3GT1的时空表达模式,以及花色苷的积累模式一致,此外,Tf MYB2、Tf MYB3和Tfb HLH1在三种材料花瓣中的表达差异与Tf DFR1、Tf ANS1和Tf3GT1在三种材料中的表达差异一致,而Tf MYB4与Tf CHS1、Tf CHI2和Tf F3H1在三种材料中的表达差异一致,表明Tf MYB2、Tf MYB3和Tfb HLH1可能参与了花瓣中Tf DFR1、Tf ANS1和Tf3GT1的表达调控而Tf MYB4可能参与了花瓣中Tf CHS1、Tf CHI2和Tf F3H1的表达调控。6.CHS和ANS分别为花色苷生物合成途径上、下游关键基因,为进一步研究转录因子对结构基因的调控作用,分析了Tf MYB2、Tf MYB3、Tf MYB4、Tfb HLH1对基因Tf CHS1和Tf ANS1启动子的调控作用。将Tf MYB2、Tf MYB3、Tf MYB4和Tfb HLH1编码序列与35S启动子相连,将Tf CHS1和Tf ANS1启动子与LUC报告基因相连,共同转化烟草叶片,通过测定烟草叶片中LUC基因的表达活性,检测转录因子对启动子活性的影响。结果发现,Tf MYB2和Tf MYB3单独或与Tfb HLH1共同作用能显著增强Tf ANS1启动子活性,Tf MYB4单独或与Tfb HLH1共同作用能显著增强Tf CHS1启动子活性。这个结果表明,Tf CHS1和Tf ANS1在‘Albert heijn’、‘上农早霞’和‘上农09’花瓣中的表达差异与Tf MYB2、Tf MYB3、Tf MYB4、Tfb HLH1在三种材料花瓣中的表达差异有关,即与‘Albert heijn’相比,Tf MYB2、Tf MYB3、Tf MYB4、Tfb HLH1在‘上农早霞’和‘上农09’中的表达变化可能与二者花色变化有关。