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β-N-乙酰己糖胺酶（EC 3.2.1.52）广泛分布于细菌、真菌、植物和动物体内,负责水解多种糖复合物中以β-糖苷键连接的β-N-乙酰葡萄糖胺和β-N-乙酰半乳糖胺。昆虫β-N-乙酰己糖胺酶由多个基因编码,参与几丁质降解、N-糖基化修饰、糖复合物降解以及配子结合等生理过程。几丁质是由β-N-乙酰-D-葡萄糖胺（β-N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc）以β-1,4-糖苷键连接而成的线性多糖。由于几丁质是昆虫重要的结构组分但在高等动植物体内没有分布,因此如果昆虫体内存在专一性参与几丁质降解的β-N-乙酰己糖胺酶,那么对该酶的选择性抑制将为农业害虫防治提供新的思路。本研究旨在鉴定农业害虫亚洲玉米螟体内专一性参与几丁质降解的β-N-乙酰己糖胺酶,为绿色农药的开发提供新的理论参考;同时对该酶性质和机理的表征也能够扩展对于β-N-乙酰己糖胺酶乃至糖基水解酶的认识。论文的主要研究工作包括:（一）亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的基因序列及转录水平研究（1）根据已知昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的保守片段设计引物,采用RT-PCR及RACE的方法从亚洲玉米螟五龄幼虫总RNA中获得编码β-N-乙酰己糖胺酶的基因序列（OfHEXl）,全长为2593 bp,编码594个氨基酸,Genbank登录号为DQ887769.1;（2）通过与已知晶体结构的β-N-乙酰己糖胺酶进行多重序列比对发现,Glu355、Asp240、His294、Asp354、Tyr450和Trp424等关键氨基酸残基在OfHEXl编码的氨基酸序列中均保守。OfHEXl编码的氨基酸序列与植物、鸟类和哺乳动物的β-N-乙酰己糖胺酶的一致性均为30%左右,但是与其它昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的同源性在27%-76%之间。系统树分析显示,昆虫β-N-乙酰己糖胺酶可分为4个分支,推测分别对应不同的生理功能。OfHEXl属于分支Ⅳ,其同源性在48%-76%之间。该分支中的部分成员在几丁质降解过程中发挥作用。（3）利用RT-PCR和Real-time PCR两种方法研究OfHEXl在亚洲玉米螟不同生长发育时期的转录水平。发现OfHEXl在昆虫蜕皮、成蛹和羽化等生长发育时期其转录水平上调。推测OfHEXl参与其变态过程中的几丁质降解。（二）亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的纯化采用SOURCE30Q阴离子交换层析、CHT羟基磷灰石层析、MonoQ阴离子交换层析和Superdex200凝胶过滤层析等4步柱层析方法,从亚洲玉米螟五龄幼虫中分离纯化了β-N-乙酰己糖胺酶（OfHexl）,产量为0.47 mg/300头幼虫,活力回收率为19.67%,纯化倍数为1468倍。纯化后的OfHexl经SDS-PAGE分析为单一条带,经高分辨率凝胶过滤层析分析为单峰。（三）亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的生物化学性质表征（1） OfHexl的分子量和组成方式。在变性条件下,SDS-PAGE和MOLDI-TOF MS测定其分子量分别为68 kDa和67.0±0.3 kDa。非变性条件下,凝胶过滤层析确定其分子量为128 kDa。该酶是以同源二聚体的形式存在并以非共价的形式结合。实验测定一对二硫键的连接方式为Cys36-Cys55。根据理论和实测分子量的差异推算每个亚基上存在1-2个N-糖基化修饰。（2） OfHexl的等电点为4.7。（3）通过肽指纹图谱结合串联质谱确定了OfHexl部分氨基酸序列,证实该酶是由OfHEXl编码的。（四）亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的酶学性质表征（1） OfHexl的最适pH为7,最适温度为30℃。（2） OfHexl的最适底物为天然底物几丁二糖（（GlcNAc）2）,其kcat/Km值为3069s-1mM-1。该酶水解（GlcNAc）2的效率为已知β-N-乙酰己糖胺酶中最高,但是不能水解N-糖链底物GnGn-PA。OfHexl对于糖苷配基具有选择性,水解速率比MU-β-GlcNAc/MU-β-GalNAc为1.53,MU-β-GlcNAc/MU-β-GlcNAc-6-SO4-为156.7。OfHexl的水解产物为β-构型且不能水解不含乙酰氨基的底物MU-β-Glc,说明该酶遵循底物辅助保留机理（substrate-assisted retaining mechanism）。OfHexl水解几丁寡糖（（GlcNAc）n）的速率随（GlcNAc）n聚合度的升高而显著降低,说明该酶是典型的外切糖基水解酶。OfHexl水解pNP-β-（GlcNAc）3的初始产物为GlcNAc,说明该酶是从糖链的非还原端开始作用的。（4）与植物和人β-N-乙酰己糖胺酶相比,OfHexl对底物浓度的变化更敏感。经验证,天然底物（GlcNAc）2对其的抑制遵循双底物结合机理,其底物抑制常数Kis值为69μM。OfHexl不仅能被糖基水解酶20家族抑制剂2-ADN抑制,而且也能被糖基水解酶18家族抑制剂allosamidin抑制,Ki值分别为3.5μM和3.2μM。证实allosamidin能够选择性抑制OfHexl,而对高等动植物β-N-乙酰己糖胺酶基本无效。综上,本研究获得了编码亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的基因序列以及天然形式的酶。从该酶编码基因特征,转录水平和底物谱可以判断该酶是专一性参与昆虫几丁质降解的β-N-乙酰己糖胺酶。同时,该酶的组成方式、特殊的底物谱以及allosamidin独特的抑制谱也扩展了对β-N-乙酰己糖胺酶的认识。