【摘 要】
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食品和水的病原微生物污染是全球医疗系统和食品卫生领域面临的永恒挑战,急需一种可以快速特异地检测病原菌的方法。生物传感器作为新一代的检测系统,具有特异性好、灵敏度高、分析速度快的优点被广泛运用。噬菌体能够特异性结合宿主细菌,常被作为生物传感器的识别元件。但野生型噬菌体本身通常不产生易于光学检测的信号分子。为此,我们将酶蛋白通过体外组装方式展示到噬菌体表面上,酶催化显色底物提供光学检测信号。本文通过亲
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食品和水的病原微生物污染是全球医疗系统和食品卫生领域面临的永恒挑战,急需一种可以快速特异地检测病原菌的方法。生物传感器作为新一代的检测系统,具有特异性好、灵敏度高、分析速度快的优点被广泛运用。噬菌体能够特异性结合宿主细菌,常被作为生物传感器的识别元件。但野生型噬菌体本身通常不产生易于光学检测的信号分子。为此,我们将酶蛋白通过体外组装方式展示到噬菌体表面上,酶催化显色底物提供光学检测信号。本文通过亲和力固定的方式,将soc-β-半乳糖苷酶（soc-β-gal）蛋白展示到T4噬菌体衣壳表面上,得到展示有β-gal的T4噬菌体（β-gal T4）。偶联多克隆抗体的磁珠被用于目标菌的先期捕获分离,再由β-gal T4与目标细菌特异结合后催化底物显色,达到快速、定量检测细菌的目的。具体研究内容包含以下两个方面。（1）由亲和力固定的方式将soc-β-gal特异性展示到T4噬菌体衣壳表面的soc端。结合SDS-PAGE与催化显色底物实验验证酶的成功展示。透射电子显微镜和细菌侵染实验得出展示酶的噬菌体本身特性没有改变。此外,着重比较了两种形式的β-gal在不同条件下的稳定性及酶动力学常数。结果表明β-gal T4较游离β-gal在稳定性和对底物的亲和力方面有了显著的提升,证明了β-gal T4在酶标记方面的性能优势,及其作为细菌检测工具的潜在可能性。（2）基于β-gal T4与免疫磁分离技术夹心法检测大肠杆菌K12。β-gal T4对被磁珠捕获大肠杆菌K12的特异性结合可随着大肠杆菌一起分离,后续加入β-gal的显色底物氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷（CPRG）,并根据显色结果定量检测大肠杆菌K12浓度。结果表明,该体系对不同浓度的大肠杆菌K12具有正相关的线性响应,可以在2 h内检测到10~3 cfu/m L大肠杆菌。对其它非目标细菌的检测结果表明此方法具有良好的选择性,且成功应用到实际样品检测,表明其在实际场景中的应用潜力。
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