实验目的:机体中肾上腺素升高,作用于心肌细胞β1受体,使心收缩力增强,心率加快,心输出量和心肌耗氧量增加,使机体的血压升高,其长期作用可导致心肌肥厚和心脏纤维化。心肌细胞和成纤维化细胞是心脏组织的主要组成成分,共同维持着心脏的重要功能。在长期交感神经兴奋、高血压等情况下,心脏成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,分泌过多的胶原纤维,从而造成心脏纤维化。表皮生长因子（TGF-β）是诱导心脏纤维化的关键因素,促进成纤维细胞分化。异丙肾上腺素（ISO）是肾上腺素β受体激动剂,利用皮下高剂量注射ISO,连续14天,可诱导小鼠心脏纤维化,模拟心脏纤维化动物模型。分选连接蛋白16（Sorting Nexin 16,SNX16）属于分选连接蛋白家族,作为一种分选连接蛋白,SNX16在细胞内吞、蛋白分选、细胞信号转导、膜运输和细胞器运动等方面均起重要作用。SNX16是否参与心脏纤维化,其在此过程中的作用尚未见报道。本研究旨在探究心肌细胞特异性敲除SNX16对异丙肾上腺素诱导心脏纤维化的影响及其分子机制。实验方法:1.不同浓度梯度ISO刺激大鼠心肌细胞（H9C2）,检测TGF-β的表达量。2.利用Cas-9技术获取SNX16F/F小鼠,与Cre工具鼠（Mlc-2v,室性心肌细胞轻链特异性启动表达的Cre重组酶）交配得到心肌细胞特异性敲除SNX16（F/F+）小鼠和对照组未敲除不带Cre的（F/F-）小鼠。3.利用ISO构建心脏纤维化动物模型:取8-12周F/F-和F/F+雄性小鼠,分为两组:实验组和对照组。实验组皮下注射（每日定点单次注射）高剂量（20mg/kg/day）ISO,连续14天,诱导小鼠心脏纤维化,对照组给予等量的生理盐水。4.建模14后对小鼠进行超声心动和心电图的检测,评估小鼠心功能的情况,判断小鼠心脏纤维化模型是否构建成功。5.收集心脏组织并称重,随后固定组织、脱水包埋,切片后进行Masson染色。6.Western Blot检测心脏组织纤维化标志物确认心脏纤维化模型是否构建成功,同时检测纤维化重要细胞因子TGF-β的蛋白含量。7.大鼠心肌细胞H9C2转染SNX16质粒,Western Blot检测SNX16蛋白过表达情况,同时,分别对过表达组和对照组细胞进行ISO（10μM）刺激24小时,收集细胞和上清,检测ISO对心肌细胞胞内和分泌上清中TGF-β含量的影响。8.免疫荧光显微镜观察ISO刺激对心肌细胞过表达SNX16后胞内TGF-β表达和分布的影响。9.利用多次酶解法提取新生小鼠原代细胞,并利用贴壁时差法分离原代心肌细胞（F/F-和F/F+）和原代成纤维细胞并培养,给予原代心肌细胞10μM ISO刺激24小时后,收集其上清及细胞,将其上清按照一定比例刺激原代成纤维细胞24小时后,同样收集上清和细胞,对照组采用等量的生理盐水（Saline）。RT-q PCR检测原代成纤维细胞中α-SMA和CollagenⅢ等纤维化标志物的mRNA表达量,Western Blot检测原代成纤维细胞中CollagenⅢ的蛋白表达情况,评估成纤维细胞纤维化程度。RT-q PCR检测心肌细胞胞内TGF-βmRNA的转录情况,Western Blot检测心肌细胞胞内和上清中重要介质TGF-β的含量,评估SNX16对TGF-β由胞内向胞外分泌量的影响。实验结果:1.ISO 10μM作用24小时后,心肌细胞中TGF-β的表达量明显增加。2.mRNA及蛋白水平检测结果显示,心肌细胞特异性敲除SNX16的小鼠构建是成功的。特异性敲除心肌细胞SNX16小鼠的生长发育以及心功能与对照组小鼠之间没有明显差异。3.ISO诱导心脏纤维化的模型后,心肌细胞特异性敲除SNX16明显改善ISO介导的左心室质量增大、心电图R波振幅延长、内腔变窄、内壁变厚等参数,明显改善心脏功能。4.Masson染色结果显示,心肌细胞特异性敲除SNX16明显减少ISO介导的左心室心腔周围纤维化。5.心肌细胞特异性敲除SNX16明显减少ISO介导的心脏整体的TGF-β表达量。6.过表达SNX16可明显增加ISO介导大鼠心肌细胞H9C2中TGF-β由胞内向胞外的分泌。7.心肌细胞特异性敲除SNX16后,ISO介导的TGF-β转录减少,心肌细胞胞内的TGF-β含量较对照组高,其分泌上清中的TGF-β含量较对照组明显减少,结果表明,敲除SNX16可能减少ISO介导的TGF-β由胞内向胞外的分泌。8.ISO刺激后的心肌细胞上清分泌物明显增加成纤维细胞胞内的CollagenⅢ的转录和表达量,而特异性敲除SNX16的心肌细胞分泌物明显缓解这一成纤维细胞表型。结论:本研究结果表明,心肌细胞SNX16缺失明显缓解了ISO诱导的心脏纤维化。心肌细胞SNX16缺失可能通过减少ISO介导的TGF-β由胞内向胞外的分泌,减缓成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,减轻了心脏的纤维化。