目的:1、分离SD乳鼠背根神经节,通过Neurobasal无血清培养基培养高纯净度的背根神经节细胞,为神经系统疾病相关实验研究提供实验基础。2、通过梯度密度离心的方法提取骨髓源性单个核细胞,应用EGM-2 MV培养基诱导培养,获得高纯度内皮祖细胞,为内皮系细胞的相关实验研究提供基础。3、通过建立内皮祖细胞与背根神经节细胞共培养体系,观察共培养下内皮祖细胞对DRG细胞突起生长的影响,为慢性脊髓损伤修复研究寻求新方向。方法:1、选取新生SD大鼠,消毒后在手术放大镜下摘取背根神经节,捣碎后用胰蛋白酶消化,终止消化后用含100μg/ml鼠源性神经生长因子、0.1mg/ml L-谷氨酰胺、2%B27添加剂及青链霉素的不含血清Neurobasal培养基制成单细胞悬液,接种在提前用多聚赖氨酸包被处理过的6孔细胞培养板内,用Neurobasal无血清培养基培养48h后全量换成含5μmol/L阿糖胞苷的神经细胞培养基纯化培养,48h后全量换成不含血清的Neurobasal培养基,之后每2d换液,每天在显微镜下观察细胞生长,取培养第6d的背根神经节细胞进行NSE免疫组织化学染色以行细胞鉴定。2、选取SD大鼠,消毒后在超净台内剥离下股骨、胫骨,用Hanks Buffer冲洗髓腔获得冲洗液,添加淋巴细胞分离液应用梯度密度离心法分离单个核细胞,用内皮系细胞专项培养基(EGM-2 MV)制成单细胞悬液,接种到细胞培养瓶中诱导培养。96h后全量换液,后每3d换液,每日在显微镜下观察细胞形态。取诱导培养第6d的细胞,应用流式细胞仪对细胞表面抗原CDl33、CD34、VEGFR-2的表达情况进行检测,同时将培养至7d的细胞爬片通过荧光显微镜观察细胞对Dil-ac-LDL的摄取及对FITC-UEA-1的结合能力,即分别从细胞形态学、细胞表面抗原表达和细胞功能学三个方面鉴定成功诱导培养出高浓度的内皮祖细胞。3、分别按照实验一、二中的步骤进行背根神经节细胞和内皮祖细胞的培养,实验组分别选取培养第7d后的内皮祖细胞与培养第4d的背根神经节细胞分别接种于Transwell上、下小室,中间隔以孔径为0.3μm的聚碳酸脂膜。对照组Transwell上下室接种同实验组大致等量的背根神经节细胞。置于同一细胞培养箱中,每2d全量换一次液,每日在倒置相差显微镜下观察两组细胞的生长情况。在共培养后第2d、4d对实验组与对照组的随机选取10个视野,在倒置相差显微镜下进行观察,通过Image J软件进行计数,计算细胞突起的数量、最长突起长度和平均突起长度。结果:1、接种后的细胞悬液混浊,内有多量杂质存在。镜下观察有神经细胞、成纤维细胞和各种神经胶质细胞等。所有细胞呈圆形、体积较小,接种4h后可见部分细胞开始贴壁,神经细胞胞体的周围可见光晕。培养24h后细胞几乎全部贴壁,可见神经节细胞长出小的突起,可见到数个神经细胞成岛状存在。培养48h后,神经细胞体积较前变大,不规则形状,周围突起的数量增加,突起增粗变长。加入阿糖胞苷培养48h后,贴壁的细胞数明显减少,可见体积较大的死亡成纤维细胞漂浮存在。继续培养,细胞胞体体积逐渐增大,突起变长并增粗,互相连接,神经突起网络变得稠密。培养第7d,神经节细胞最为饱满,突起极为丰富。继续培养可见神经节细胞不再饱满,胞质减少,突起停止生长,突起逐渐弯曲、回缩,突起之间的连接部分断裂,培养液中可见漂浮的细胞碎片。培养6d后的细胞行nse免疫组织化学染色,阳性细胞的细胞质被染成棕褐色。纯度检测结果示,纯度可达90%左右。2、镜下见刚接种的细胞均呈球形,折光性较强。培养2d后可见部分细胞贴壁,可见少量细胞呈短的梭形。培养4d后,出现细胞突起,突起延伸,偶然可见细胞集落形成,可见部分细胞呈线样排列。培养7d后可见较多梭形细胞,有较明显的集落形成,细胞呈典型的线样排列。第14d可见内皮祖细胞呈多角形,细胞集落之间相互相连,呈典型的铺路石样改变。单个核细胞经过egm-2mv培养基诱导培养7d后,通过流式细胞仪对细胞表面抗原表达情况进行检测示:细胞表型表达情况符合已知内皮祖细胞抗原的表达特点。培养第7d的爬片细胞摄取dil-ac-ldl的细胞胞质呈现红色荧光,摄取fitc-uea-1的细胞胞质被染成绿色荧光,合成图像呈双荧光染色阳性(黄色)的细胞阳性率>70%。双染阳性细胞阳性为内皮细胞的前体。3、镜下见培养1d后,实验组与对照组相对比背根神经节细胞胞体折光性较强,突起较多。培养2d、4d后,实验组与对照组相对比可见背根神经节细胞突起较长,细胞之间网状结构更紧密。在细胞共培养的第2d、4d,细胞共培养组中细胞突起的数量、最长突起和平均突起长度均较对照组有明显增长,两组数据比较差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:1、摘取新生乳鼠的背根神经节,用neurobasal培养基培养,通过48小时后加入阿糖胞苷来抑制杂志细胞的生长,成功分离培养出了相对纯净度高的背根神经节细胞。2、应用梯度密度离心法提取大鼠骨髓单个核细胞,接种后用egm-2mv培养基进行诱导,通过细胞形态学变化,表面抗原鉴定及细胞功能学鉴定,表明提取的单个核细胞经诱导可以获得多量高纯度的内皮祖细胞。3、共培养下EPCs能够提高背根神经节细胞突起的生长能力,说明内皮祖细胞对背根神经节的生长有一定的促进作用。这种促进作用很有可能是内皮祖细胞分泌的一系列细胞因子协同作用的结果,这可为局部细胞移植治疗慢性脊髓损伤提供研究基础。