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近年来,随着环境污染的日益严重、老龄化的加重及人们不良生活习惯的增多,癌症发病人数及因癌症死亡人数呈逐年递增的趋势。癌症转移是造成各种肿瘤疾病致死的主要原因,约有90%的癌症病人死于癌转移。传统的癌症治疗手段一般对人体存在较大的毒副作用,且并不总是有效。因此急需开发高效能低成本的抗肿瘤药物。白细胞介素(IL)-24是一种新型细胞因子,属于IL-10家族成员,体内外活性研究均显示其具有选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长的功能,对正常细胞没有毒性作用。IL-24的这一特点使其在治疗肿瘤疾病方面有较大的应用潜力,成为近年来研究的热点。Contortrostatin (CN)是从铜头蝮蛇毒素中提取的一种同源二聚体解离素多肽,通过其C-端柔性环区域的RGD序列与肿瘤细胞和血管内皮细胞的高亲和力相互作用,能够显著地抑制肿瘤细胞转移和肿瘤血管的生成,是唯一最具潜力用于治疗转移性癌症的蛇毒素提取物。本文对IL-24和IL-24-CN融合蛋白在大肠杆菌中的重组表达及生物学活性进行了研究。为了实现IL-24在大肠杆菌中的非融合表达,我们优化了IL-24mRNA翻译起始区(TIR)的二级结构,使mRNA TIR序列自由能由-22.0kcal/mol降低为-9.07kcal/mol,降低了约2.4倍,促进了较为疏松的二级结构的形成。通过PCR、酶切和连接,我们成功将IL-24突变基因克隆至pET-32a(+)。将重组质粒转化大肠杆菌,诱导表达结果显示与非优化(几乎没有表达)相比IL-24的表达水平显著提高,达菌体总蛋白的26%。我们通过两步包涵体洗涤、变复性和离子交换色谱纯化获得了纯度约为93%的nrIL-24。为了增强IL-24的抗肿瘤活性,我们构建了IL-24-CN融合表达质粒pET32a-IL24-CN,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)pLysS,诱导表达结果显示融合蛋白以可溶形式表达,可溶表达量达破碎上清的39.3%。我们建立了融合蛋白的分离纯化及标签切除工艺,获得了较高纯度的IL-24-CN。本文分别采用MTT比色法、流式细胞术、伤口愈合实验和Trans well实验对重组蛋白的活性进行了验证,并初步分析了IL-24-CN抗肿瘤活性机制。(1)MTT结果显示nrIL-24和IL-24-CN可呈浓度依赖型抑制恶性黑色素瘤A375细胞的生长,IL-24-CN表现出更高的抑制活性。为了进一步确定这种生长抑制作用与诱导凋亡作用的关系,我们进行了annexin V/PI双染实验,与对照组相比nrIL-24和IL-24-CN均能显著诱导A375细胞的凋亡,诱导凋亡率分别为16.8%和26.8%。实验结果表明nrIL-24和IL-24-CN可通过诱导A375细胞的凋亡抑制其生长,且IL-24-CN对A375细胞具有更强的抑制活性。(2)我们首先采用伤口愈合实验分析了重组蛋白对A375细胞迁移的影响,结果表明,24h后以PBS处理的对照组划痕明显变小,与实验组相比A375细胞有明显的迁移,迁移率为33.07%。以nrIL-24处理的A375细胞划痕距离也有减小,迁移率为26.59%。以IL-24-CN处理的肿瘤细胞迁移距离最小,迁移率为16.82%,说明IL-24-CN对肿瘤细胞的迁移有显著的抑制作用且活性强于nrIL-24,迁移抑制率为49.14%。(3) Transwell实验验证了上述结果,nrIL-24对A375的迁移和侵袭都有一定的抑制作用,相对抑制率分别为24.68%和13.56%。IL-24-CN对A375细胞的迁移和侵袭有明显的抑制作用,相对抑制率分别为51.95%和45.76%。(4)通过检测肿瘤细胞与已包被nrIL-24和IL-24-CN的平板的结合能力,反映重组蛋白对肿瘤细胞的亲和力,同时设置只包被BSA的孔板为对照。只包被BSA的孔板几乎没有A375细胞的粘附,包被重组蛋白nrIL-24的孔板有少许A375细胞被粘附于板底,包被IL-24-CN的孔底对A375细胞的粘附数量显著增多,这也说明CN对肿瘤细胞有较强的亲和力,通过与CN的融合表达可提高IL-24到肿瘤细胞表面的靶向性。综上所述,本研究通过非融合表达策略实现了重组IL-24的高效制备,纯化获得的nrIL-24可显著诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长,且对肿瘤细胞的迁移和侵袭有一定抑制作用。本研究还构建了IL-24-CN的可溶表达系统,初步建立了重组蛋白的纯化工艺,IL-24-CN具有比nrIL-24更强的肿瘤生长抑制活性,且可显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭,说明CN与IL-24的融合表达策略对提高其抗肿瘤活性有协同作用。本研究的工作为IL-24其进一步的活性研究及应用于癌症治疗奠定了基础。