论文部分内容阅读
革兰阴性菌是临床常见的病原微生物。细菌壁外膜的内毒素（Endotoxin）又称脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是其主要致病成分，具有广泛的生物活性，能引起严重的炎症级联反应，是导致脓毒症、系统性炎症反应综合征、多脏器功能衰竭的主要致病因子。内毒素血症自Richrd Pfeiffe首次报道至今已近一个世纪，其高发病率及死亡率是长期以来一直困扰医学界的一大难题。目前针对内毒素仍尚无有效的办法。内毒素耐受（endotoxin tolerance）是指预先注射小剂量或亚致死量LPS后，机体对大剂量或致死量LPS呈低反应甚至无反应的现象，其主要特征是内毒素导致的一系列诸如发热、体重下降、死亡等病理生理现象减轻甚至消失。内毒素耐受后再次受炎症刺激时促炎症细胞因子（如TNF-α、IL-1、INF-γ等）产生能力下降。体外实验也显示巨噬细胞用低剂量LPS预处理后再次用LPS刺激，TNF-α产生显著下降。目前，内毒素耐受的机制尚未完全阐明。独立生长因子1（Growth Factor Independence 1，Gfi1）是一种核锌指蛋白（分子量55kD），有6个羧基端为C2H2样锌指区域，在N端有典型的SNAG区（20个氨基酸），分布在造血系统，淋巴系统，还有感觉上皮，肺，部分中枢神经系统。Gfi1主要功能有：通过增强组蛋白脱乙酰作用来抑制基因转录；限制造血干细胞的增殖，保持其功能；促进中性粒细胞分化；促进Th2细胞增殖及存活。Gfi1缺乏的小鼠会导致严重的粒细胞缺乏。已有的研究表明Gfi1是一种新的能抑制TLR4介导的天然免疫反应的因子。Gfi1-/-小鼠显示对LPS很强的全身反应，出现感染性休克症状很快在36h内死亡。Gfi1缺乏小鼠经小剂量LPS刺激（腹腔注射）即能引起肺部严重的炎症反应，肺部很快有淋巴细胞积聚，TNF，Il-1β，IL-6等炎症因子大量产生。体外实验表明LPS刺激后肺泡巨噬细胞能表达Gfi1，Gfi1-/-小鼠肺泡巨噬细胞LPS刺激后产生大量TNF、IL-6，表明肺泡巨噬细胞存在Gfi1依赖的机制调节细胞因子产生。结合已有的研究：Gfi1能抑制天然免疫反应，Gfi1缺乏小鼠LPS刺激后肺部炎症反应强，炎症因子产生增多。内毒素耐受为小剂量LPS预处理后接受大剂量LPS时炎症反应减轻，促炎症细胞因子产生下降。我们设想在内毒素耐受后再用LPS刺激时Gfi1表达增强，发挥了抑制促炎症细胞因子产生的作用。因此本实验通过建立内毒素耐受小鼠模型以及体外巨噬细胞内毒素耐受细胞模型旨在研究Gfi1在内毒素耐受形成机制中的作用。第一部分Gfi1在内毒素耐受小鼠肺组织中的作用研究目的：观察独立生长因子1（Gfi1）在内毒素耐受小鼠接受大剂量内毒素（LPS）刺激前后肺组织中的表达。方法：74只雌性C57BL／6小鼠随机分两组，对照组连续4天腹腔注射0.9％NaCl，第5天腹腔注射10mg／kg LPS；内毒素耐受组连续4天腹腔注射1mg/kgLPS，第5天腹腔注射10mg／kg LPS建立小鼠内毒素耐受模型。比较两组小鼠一般情况及存活率。分别在注射大剂量LPS前（0h），注射后2h、6h、12h、24h观察肺组织病理，ELISA检测肺组织TNF-α，RT-PCR检测肺组织Gfi1 mRNA，免疫组化检测肺组织Gfi1蛋白表达。结果：（1）和正常对照组小鼠相比，内毒素耐受组小鼠注射大剂量LPS后一般情况良好，存活率高，肺组织炎症反应轻，LPS刺激后TNF-α水平未见上升，内毒素耐受动物模型复制成功。（2）对照组小鼠腹腔注射大剂量LPS后2h肺部就出现炎症细胞浸润等炎症反应，6h、12h炎症反应最显著，24h减轻。内毒素耐受组注射大剂量LPS后6h、12h炎症反应较对照组明显减轻，2h、24h相似。（3）注射大剂量LPS前0h，注射后2h、6h、12h、24h小鼠肺组织Gfi1的mRNA相对值表达：对照组分别为0.2271±0.1252、0.1716±0.1474、0.2151±0.0950、0.4259±0.2550、0.4120±0.1618；内毒素耐受组分别为0.5618±0.2222、0.6305±0.2362、0.9046±0.2914、0.5335±0.2928、0.3552±0.1468。对照组和内毒素耐受组相比，0h、2h、6h耐受组小鼠肺组织Gfi1 mRNA的表达显著高于对照组，差异均有统计学意义（0h时p＜0.05，2h及6h时p＜0.01）。12h、24h耐受组和对照组相比差异无统计学意义（p＞0.05）。（4）在小鼠肺组织中Gfi1蛋白表达主要分布在肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞。注射大剂量LPS前0h，注射后2h、6h、12h、24h小鼠肺组织Gfi1蛋白免疫组化阳性指数：对照组分别14725.81±2311.01、18599.45±2681.13、18400.85±2631.86、14101.41±2734.11、20462.01±3468.31；内毒素耐受组分别为18429.09±2315.09、17710.28±3153.19、22791.63±2273.45、23184.17±2811.97、20219.83±2574.17。LPS刺激后较LPS刺激前Gfi1蛋白表达明显增加。内毒素耐受组在0h、6h、12h时小鼠肺组织Gfi1表达显著高于同时间点对照组（p＜0.01）；2h、24h时耐受组和对照组小鼠肺组织Gfi1表达差异无统计学意义（p＞0.05）（5）注射大剂量LPS前0h，注射后6h，ELISA检测小鼠肺组织TNF-α水平：对照组分别为55.12±12.25pg/ml、94.00±17.38pg/ml；耐受组分别为105.93±26.14 pg／ml、51.10±10.08 pg／ml。0h耐受组TNF-α水平较对照组明显升高，差异有统计学意义（p＜0.01）。对照组小鼠肺组织TNF-α浓度6h较0h明显升高，差异有统计学意义（p＜0.01）。耐受组小鼠肺组织TNF-α浓度6h较0h明显降低，差异有统计学意义（p＜0.01）。结论：内毒素耐受时，大剂量内毒素引起的肺部炎症反应较轻可能与肺部Gfi1高表达有关。第二部分Gfi1在体外巨噬细胞内毒素耐受中的作用研究目的：观察小鼠巨噬细胞株RAW264.7和原代小鼠腹腔巨噬细胞体外内毒素耐受后用大剂量LPS刺激前后Gfi1的表达，探讨Gfi1在体外巨噬细胞内毒素耐受中作用。方法：（1）用100 ng／ml LPS预先刺激两种细胞20h复制体外内毒素耐受细胞模型，后用1000 ng／ml LPS刺激。对照组直接用1000 ng／ml LPS刺激。（2）Real-time PCR检测RAW284.7和小鼠原代腹腔巨噬细胞体外内毒素耐受后用1000 ng／ml LPS刺激前（0h），刺激后2h、6h、12h、24h Gfi1 mRNA表达。（3）Western blot检测RAW264.7细胞体外内毒素耐受后用1000 ng/ml LPS刺激前（0h），刺激后2h、6h、12h、24h Gfi1蛋白表达。（4）ELISA检测RAW264.7内毒素耐受后用1000 ng／ml LPS刺激前（0h），刺激后2h、6h、12h、24h细胞培养上清中TNF-α、IL-6浓度。ELISA检测小鼠原代腹腔巨噬细胞各时间点细胞培养上清中TNF-α浓度。结果：（1）1000 ng／ml LPS刺激后6h对照组细胞培养液上清TNF-α浓度较0h明显上升，内毒素耐受组细胞培养液上清TNF-α浓度较0h反而明显下降。两种细胞体外内毒素耐受细胞模型复制成功。（2）RAW264.7细胞大剂量LPS刺激前（0h）、刺激后2h、6h、12h、24h Real-timePCR检测Gfi1 mRNA水平，对照组分别为1.45E-05±2.27E-06、4.87E-05±6.66E-06、1.21E-04±1.91E-05、1.91E-04±3.20E-05、1.33E-04±1.91E-05；耐受组分别为4.04E-05±3.00E-06、5.46E-05±8.22E-06、2.09E-04±4.33E-05、2.14E-04±1.30E-05、1.42E-04±2.64E-05。其中0h、6h耐受组Gfi1 mRNA表达较对照组相应时间点明显升高（p＜0.05）。（3）原代小鼠腹腔巨噬细胞大剂量LPS刺激前（0h）、刺激后2h、6h、12h、24hReal-time PCR检测Gfi1 mRNA水平：对照组分别为2.19E-06±7.49E-07、1.49E-05±4.97E-06、2.07E-05±7.93E-06、3.52E-05±1.29E-05、3.87E-05±1.38E-05；耐受组分别为4.68E-06±6.89E-07、3.44E-05±9.92E-06、5.29E-05±1.11E-05、3.67E-05±9.80E-06、3.97E-05±1.27E-05。耐受组0h、2h、6h同对照组相比Gfi1 mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（0h、2h p＜0.05，6hp＜0.01）。（4）RAW264.7细胞大剂量LPS刺激前（0h）、刺激后2h、6h、12h、24h westernblot检测Gfi1蛋白水平：对照组分别为0.232±0.054、0.291±0.037、0.296±0.040、0.512±0.045、0.320±0.032；耐受组分别0.471±0.064、0.364±0.043、0.539±0.041、0.604±0.036、0.325±0.032。耐受组0h、6h、12h Gfi1蛋白表达较对照组明显升高，差异有统计学意义（0h、6h p＜0.01，12h p＜0.05）。（5）RAW264.7细胞大剂量LPS刺激前（0h）、刺激后2h、6h、12h、24h ELISA检测细胞培养上清TNF-α浓度：对照组分别为132.50±42.58、162.14±32.49、410.25±9.79、521.63±53.83、509.68±19.56pg／ml；耐受组分别为480.59±25.21、90.32±14.73、240.03±12.81、291.27±25.23、278.99±34.09 pg／ml。耐受组0hTNF-α浓度较对照组明显升高，差异有统计学意义（p＜0.01）。耐受组6h，12h，24h TNF-α浓度较对照组明显降低，差异有统计学意义（6h、12h p＜0.01，24hp＜0.05）。（6）原代小鼠腹腔巨噬细胞大剂量LPS刺激前（0h）、刺激后2h、6h、12h、24hELISA检测细胞培养上清TNF-α浓度：对照组分别为15.51±6.74、610.95±85.21、769.69±139.52、829.24±54.24、788.82±23.86 pg／ml：耐受组分别为907.04±33.25、410.15±142.51、430.27±55.61、579.36±18.70、801.41±54.89 pg/ml。耐受组0h TNF-α浓度较对照组明显升高，差异有统计学意义（p＜0.01）。耐受组6h，12h，TNF-α浓度较对照组明显降低，差异有统计学意义（6h p＜0.05，12h p＜0.01）。（7）RAW264.7细胞大剂量LPS刺激前（0h）、刺激后2h、6h、12h、24h ELISA检测细胞培养上清IL-6浓度：对照组分别为7.25±2.66、14.77±4.97、608.18±77.10、855.54±62.27、821.14±60.59 pg／ml；耐受组分别为368.52±50.71、74.46±12.57、245.34±31.30、256.94±43.81、452.17±65.03 pg／ml。耐受组0h、2h IL-6浓度较对照组明显升高，差异有统计学意义（0h p＜0.01，2h p＜0.05）。耐受组6h，12h，24h IL-6浓度较对照组明显降低，差异有统计学意义（p＜0.01）。结论：在体外内毒素耐受细胞模型中，RAW264.7和小鼠原代腹腔巨噬细胞耐受组在用大剂量LPS刺激后Gfi1 mRNA和RAW264.7细胞的Gfi1蛋白表达水平均较对照组高，Gfi1可能参与了内毒素耐受的形成机制。