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本研究室从泰山林地土壤中分离获得一株高效拮抗菌BS-112,该菌株能够产生两类抗菌物质,其中,抗真菌活性物质为多烯大环内酯抗生素,对黄曲霉、赭曲霉、黑曲霉等粮食和饲料中常见的霉菌具有较强的抑制作用,且理化性质稳定,毒性低;抗细菌活性物质是一种胞外多糖,对大肠杆菌、金黄葡糖球菌、鼠伤寒沙门氏菌等病原细菌具有较广谱的抗性,尤其对家蚕黑胸败血病菌的抑制作用强,且具有抗氧化活性;本研究对该菌株进行了鉴定,采用摇瓶发酵方法分别优化了两种抗菌物质的发酵培养基配方及条件,并对两类抗菌物质进行了分离纯化,并研究了其结构与性质。主要研究结果如下。
1、BS-112菌株的鉴定根据菌体形态特征、培养特征、理化性质、细胞壁组分及16S rDNA序列分析结果,将BS-112菌株鉴定为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。该菌株的16S rDNA序列已在GenBank注册,登录号为:EU529841,菌株专利保藏编号为:CGMCC No.3504。
2、抗真菌活性物质的发酵培养基配方及发酵条件的优化通过单次单因子试验、正交试验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡和中心组合试验对抗真菌活性物质发酵培养基及发酵条件进行了优化。
最佳培养基配方为:玉米粉10.0 g/L、葡萄糖18.61 g/L、黄豆饼粉31.15 g/L、MgSO4 0.7 g/L、KH2PO4 0.38 g/L。
最佳发酵条件为:种龄48 h,接种量1%(v/v),发酵温度28 ° C,摇瓶装液量50 mL/250 mL或120 mL/500 mL,转速200 r/m,发酵时间84 h,初始pH7.0-7.5。
运用最佳发酵培养基和最佳发酵条件摇瓶发酵,发酵液的效价达到5829.81 μg/mL,较基础培养基提高了367.98%。
3.抗真菌活性物质的分离纯化抗真菌活性物质经大孔吸附树脂X-5吸附层析得到活性物质的提取物,再经甲醇抽提、硅胶柱层析获得中间纯化物,最后经高效液相色谱,获得4个抗真菌活性组分。4个活性组分经分析型UPLC纯度验证,其纯度已达到化学结构测定的要求。
4.抗真菌活性物质的理化性质与生物学性质紫外全波长光谱扫描发现抗真菌活性组分F1、F2、F3、F4属于四烯大环内酯抗生素。采用电喷雾质谱(ESI-MS)、核磁共振谱(1HNMR、13CNMR、gCOSY、gHMQC、gHMBC)波谱法对活性组分F1、F2、F3、F4进行结构解析,确定4个活性组分的结构分别为Tetrins A和B、Tetramycins A和B。
Tetrins A和B、Tetramycins A和B易溶于甲醇、乙醇、二甲基亚砜等有机溶剂,对热稳定,对酸碱稳定,对紫外线敏感。
抗真菌活性物质的抑菌谱广,对黄曲霉、赭曲霉、黑曲霉等多种病原真菌具有较强的抑制作用。96孔板法测得抗真菌活性物质对黄曲霉的MIC和MFC分别为6.25 μg/mL和12.56 μg/mL。抗真菌活性物质对花生的防霉效果明显,对家蚕的生长发育无不良影响。将Tetrins A和B、Tetramycins A和B以2000 mg/kg剂量灌胃小鼠,小鼠无急性毒性表现。
5.抗细菌活性物质的发酵培养基配方及发酵条件的优化通过单次单因子试验、正交试验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡和中心组合试验对抗细菌活性物质发酵培养基及发酵条件进行了优化。
最佳培养基配方为:玉米粉25.0 g/L、黄豆饼粉15.0 g/L、葡萄糖1.76 g/L、(NH4)2SO4 0.92 g/L、CaCO3 3.17 g/L、MgSO4 0.75 g/L。
最佳发酵条件为:种龄48 h,接种量2%(v/v),发酵温度28 ° C,摇瓶装液量50 mL/250 mL或100 mL/500 mL,转速200 r/m,发酵时间72 h,初始pH7.0-8.0。
运用最佳发酵培养基和最佳发酵条件摇瓶发酵,发酵液的效价达到15965.36 μg/mL,较基础培养基提高了529.6%。
6.抗细菌活性物质的分离纯化抗细菌活性物质是一种胞外多糖,采用乙醇沉淀的方法得到具有抗细菌活性的粗多糖,经凝胶过滤层析和离子交换层析获得抗细菌多糖的中间纯化物,经高效液相凝胶过滤色谱得到一个抗细菌活性组分。
7.抗细菌活性物质的理化性质与生物学性质抗细菌活性物质对热稳定,对酸碱稳定,对紫外线不敏感。抗细菌活性物质是一种具有抗细菌活性的胞外多糖,分子量约为2233 Da,抗细菌多糖的单糖组成为β-D-吡喃葡萄糖。
抗细菌活性物质的抑菌谱广,对大肠杆菌、黑胸败血病菌、鼠伤寒沙门氏菌等多种病原细菌具有较强的抑制作用。试管肉汤二倍稀释法测得抗细菌活性物质对大肠杆菌K12的MIC和MBC分别为6.25 μg/mL和12.56 μg/mL。抗细菌活性多糖对家蚕的生长发育无不良影响;对小鼠的急性毒性试验结果表明,抗细菌活性多糖对小鼠无急性毒性表现。抗细菌活性多糖具有抗氧化的作用,对超氧阴离子、羟基自由基、DPPH自由基均具有清除作用。