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前言:慢性疼痛或晚期癌痛的治疗研究一直是生命科学的重要课题之一，传统的药物治疗有着诸多不可避免的缺陷。上世纪后期兴起的转基因细胞移植镇痛是细胞镇痛领域中的新亮点，被认为是一种接近于生理的、有效的镇痛方法。本研究拟通过鞘内移植人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株，观察其对大鼠慢性神经病理性疼痛的镇痛效应，旨在将这一现代生物镇痛技术引入于临床奠定基础。
研究方法:
1.猿肾病毒40大T抗原永生化的大鼠星形胶质细胞株的构建。
采用差速粘附法体外分离和培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞(AST)；利用脂质体将含有猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)的质粒pCMVSV40T/PUR体外转染大鼠星形胶质细胞；采用含嘌呤霉素1.5μg/ml的培养基筛选，挑选阳性细胞克隆扩大培养并连续传代PCR、RT-PCR及免疫细胞化学法检测阳性细胞克隆中SV40Tag基因的整合情况及其表达；免疫细胞化学法检测转化细胞的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。
2.猿肾病毒40大T抗原永生化大鼠星形胶质细胞株生物学特性的研究。
选用连续传代培养的永生化大鼠星形胶质细胞株和未转化的大鼠星形胶质细胞，观察传代、冻存和复苏对细胞形态及生长的影响；比较两种细胞的生长特性和绘制生长曲线；透射电镜观察细胞的超微结构变化；利用5’溴-2-脱氧尿苷掺入法和流式细胞仪检测细胞增殖率和增殖周期；双层软琼脂培养和裸鼠接种成瘤性实验。
3.人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株的构建。
采用DNA重组技术将质粒pCMVhPPE.SEQ中的人前脑啡肽原基因(hPPE)克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上，重组为真核表达载体pcDNA3.1(+)-hPPE，酶切鉴定和测序分析；采用脂质体介导法分别将重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE和空质粒pcDNA3.1(+)体外转染永生化大鼠星形胶质细胞株；用含G418600μg/ml的筛选培养基筛选，挑选阳性细胞克隆并扩大培养；RT-PCR检测Neo基因的存在以证实转染是否成功；RT-PCR、免疫细胞化学法和放射免疫法分别检测细胞hPPEmRNA和亮氨酸脑啡肽(L-EK)蛋白的表达及其分泌水平。
4.鞘内植入人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株对大鼠慢性神经痛的镇痛作用。
选择40只成年雄性SD大鼠(150～200克)，随机分为四组：空白组(Naive组)、保留性神经损伤组(SNI组)、保留性神经损伤+移植永生化星形胶质细胞株组(SNI+IAST组)和保留性神经损伤+移植人前脑啡肽原基因修饰的永生化星形胶质细胞株组(SNI+IAST/hPPE组)；按照Woolf的方法建立右侧保留性神经损伤模型(sparednerveinjury，SNI)；SNI后1周于大鼠脊髓L4-6水平鞘内置管并植入同5’溴-2-脱氧尿苷(BrdU)预培养的永生化大鼠星形胶质细胞株或人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株(约105～106个细胞)；分别于SNI前、SNI后1周和细胞植入后的6周内每周采用VonFrey丝法测定各组大鼠左右两侧对机械刺激的50％缩爪阈值(PWT)的差值；细胞移植后第3周将SNI+IAST/hPPE组大鼠分为两组，即纳洛酮组和生理盐水组，观察腹腔注射纳洛酮对移植IAST/hPPE细胞镇痛效应的影响；细胞植入后第6周取各组大鼠L4-6脊髓组织，运用免疫组织化学法和放射免疫法分别检测亮氨酸脑啡肽在L4-6脊髓背角组织的表达，免疫细胞化学法检测移植细胞BrdU的表达，借此判断细胞存活的情况。
5.统计分析
实验结果以均数±标准差((-x)±s)表示。组间多个样本均数的多重比较采用单因素方差分析。若方差具有齐次性时，选择最小显著性差异法(LSD)；若方差不具有齐次性时，选择TamhanesT2法进行统计分析。以P＜0.05作为差异有统计学意义的检验标准。采用SPSS(10.0)统计软件包处理。
研究结果:
1.成功体外培养大鼠星形胶质细胞，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性；筛选获得阳性细胞克隆，连续传代培养近50代；PCR、RT-PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析显示558bp处有一特异性扩增条带，与阳性对照条带相同，而未转染细胞无扩增条带；回收片段经测序、比对与SV40Tag的基因序列一致(100％)；同时，筛选的阳性细胞克隆胞核猿肾病毒40大T抗原(SV40Tag)和胞浆GFAP免疫染色阳性。该细胞命名为永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST)。
2.永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST)体外可连续传代50次以上，未出现衰变迹象，而未转化的大鼠星形胶质细胞(AST)传至10代左右即出现复制衰老现象；IAST细胞生长呈单层，锚着依赖和接触抑制生长；传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无影响；IAST增殖旺盛，与第10代AST细胞(AST10)相比，增殖指数升高(30.66±3.43％vs9.63±2.55％，P＜0.01)、群体倍增时间缩短(19.58±2.14小时vs49.98±3.16小时，P＜0.01)和增殖率提高(71.70±7.17％vs21.21±3.15％，P＜0.01)；软琼脂培养无集落形成，裸鼠接种无新生物生长。
3、重组质粒经酶切后分别出现5.4kbp和950bp片段，测序分析与文献报道结果一致，表明重组质粒pcDNA3..(+)-hPPE亚克隆成功；Neo基因检测显示重组质粒和空质粒已成功转染至IAST细胞中，筛选获得IAST/hPPE和IAST/Neo两个细胞株；亮氨酸脑啡肽(L-EK)免疫染色均阳性，但IAST/hPPE细胞株L-EK表达的平均光密度值(0.3458±0.0156)明显高于IAST/Neo和IAST(0.2545±0.0131和0.2456±0.0163)(P＜0.01)；IAST/hPPE细胞株hPPEmRNA的积分吸光度值与内参β-actin的比值(0.1157±0.0055)明显高于IAST/Neo和IAST(0.0668±0.0045和0.0654±0.0051)(P＜0.01)；IAST/hPPE培养上清液中L-EK的含量(354.77±45.25pg/ml)明显增高，而IAST/Neo与IAST细胞相比差异无统计学意义(112.98±13.85pg/mlvs117.10±12.68pg/ml，P＞0.05)。
4.SNI后1周大鼠右足即出现痛觉异常现象，与Naive组相比，其余三组的左右侧50％PWT的差值明显增大(P＜0.01)；SNI+IAST/hPPE组于细胞移植后1至6周痛觉异常症状明显减轻，而SNI组和SNI+IAST组未见明显变化；SNI+IAST/hPPE组左右侧50％PWT差值与SNI组和SNI+IAST组相比明显减小(P＜0.01)，而SNI组和SNI+IAST组间差异无统计学意义(P＞0.05)；Na(i)ve组脊髓L-EK表达的平均光密度值(0.3531±0.1130)明显低于其余三组(P＜0.01)，SNI组与SNI+IAST组相比差异无统计学意义(0.6834±0.1089vs0.7164±0.1347，P＞0.05)，而SNI+IAST/hPPE组(1.3353±0.2925)明显高于其他三组(P＜0.01)；IAST/hPPE组每毫克脊髓L-EK的含量(108.0965±12.5162pg/mg)明显高于Na(i)ve组、SNI组和SNI+IAST组，差异具有显著性(P＜0.01)；而SNI组与SNI+IAST组相比差异无统计学意义(25.3655±1.8791pg/mgvs27.9494±2.0716pg/mg，P＞0.05)，但高于Na(i)ve组(14.3439±0.9815pg/mg，P＜0.01)；腹腔注射纳洛酮可拮抗鞘内移植IAST/hPPE细胞株的镇痛效应；SNI+IAST组和SNI+IAST/hPPE组脊髓背角软脑膜表面移植细胞的BrdU免疫染色阳性，表明移植后6周细胞仍然存活。
研究结论:
1.成功构建了SV40Tag基因永生化的大鼠星形胶质细胞株。
2.SV40Tag永生化大鼠星形胶质细胞株在体外能长期培养并维持分裂增殖能力，保留了原始星形胶质细胞特征性的分化表型，属良性转化细胞，可将其作为转基因的种子细胞用于疼痛方面的研究。
3.成功构建了人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/hPPE)，体外可大量表达和分泌脑啡肽，为该细胞移植用于镇痛的研究奠定了基础。
4.大鼠鞘内移植IAST/hPPE细胞可以减轻慢性神经性疼痛，其镇痛效应与移植细胞持续分泌的脑啡肽作用于阿片受体有关。
研究总结:本研究通过构建猿肾病毒40大T抗原永生化大鼠星形胶质细胞株，体内、外证实为无致瘤性的良性转化细胞，体外培养可以获得大量生物学特性均一的神经细胞株，解决了原代神经细胞培养数量及生存时间有限等的问题；通过大鼠鞘内植入高表达脑啡肽的人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株，动物行为学观察证实该细胞株对慢性神经痛大鼠具有抗伤害作用，可获得长效、稳定、安全、满意的镇痛效果，其作用与移植细胞持续分泌的脑啡肽作用于阿片受体有关。因此，这一技术可形成产品化的表达抗痛蛋白分子的永生化镇痛细胞库，为现代细胞镇痛的研究提供理想的材料，推动这一新兴的生物镇痛技术的发展。