魁蚶(Scapharca broughtonii)属于软体动物门(Mollusc),双壳纲(Bivalve),蚶目(Arcoida),蚶科(Arcoidae),毛蚶属(Arca))。壳面有42-48条放射肋,以43条者居多。主要分布于我国渤海及黄海北部。魁蚶因其个体大、生长快,肉味鲜美,富含蛋白质和多种维生素,具有很高的经济价值,是我国出口换汇率较高的水产品之一。近几年来,我们课题组对魁蚶的血细胞形态、免疫功能及种质资源和遗传多样性做过研究,发现魁蚶对鳗弧菌具有较强的抗菌功能。早期野生魁蚶资源丰富,市面上销售的也都是野生捕捞种。近年来,近海养殖规模的不断扩大和人类活动的日渐频繁,导致滩涂生态环境恶化,加之过度捕捞,野生魁蚶群体出现病害和资源量下降的现象。为恢复其资源,魁蚶增殖放流和人工养殖便应运而生,且发展迅猛,为防止魁蚶在规模化养殖过程中爆发病害,需加强魁蚶抗病选育及其免疫机制研究。然而相关研究报道还较少,主要是运用传统分析学方法在细胞水平上对血细胞及其免疫功能等进行一些基础性的研究,有关魁蚶免疫系统作用的分子机制研究在国内外几乎还是空白。魁蚶功能基因的研究可为疾病防治提供理论基础,因此发掘魁蚶免疫基因、加强免疫机制研究显得尤为重要,深入挖掘魁蚶免疫因子对其产业的发展具有重要的理论和现实意义。本研究通过Illumia HiseqTM 2000技术构建并分析魁蚶转录组文库。采用拼接软件Trinity对所得序列进行de-novo组装,共获得86,689条高质量unigenes(>200 bp),总长度为71,873,603 bp,平均长度829 bp,N50长度为2256 bp,N90长度是454 bp,最长的序列为33,269 bp。通过BLAST比对进行基因功能注释:共有22,117(25.51%)条unigenes在Nr数据库中存在相似序列,分别有21,404(24.69%)、21,207(24.46%)条unigenes在GO和PFAM数据库中注释成功,在注释成功的序列中有7,531条序列被定位在31个KEGG的通路当中。结果表明:构建的魁蚶转录组文库质量较高,筛选获得的免疫相关unigenes为魁蚶功能基因的分子克隆和研究奠定基础。采用RACE技术克隆获得魁蚶锰超氧化物歧化酶(Mn SOD)基因全长c DNA序列,命名为Sb Mn SOD。序列结构分析表明:Sb Mn SOD基因c DNA全长1003 bp,5’-和3’-非编码区(UTR)分别为32 bp、275 bp;开放阅读框长696 bp,编码一个由232个氨基酸组成的多肽,预测的蛋白分子量为25.67 KDa,理论等电点为7.13。;4个负责与金属离子Mn2+结合的保守氨基酸残基分别为His57,His105,Asp190,His194;Mn SOD的特征序列为-DVWEHAYY-。同源性分析结果表明,Sb Mn SOD氨基酸序列与其他软体动物Mn SOD氨基酸序列的相似性达66%-91%,与蟹类的相似度高于虾类。q RT-PCR结果显示:Sb Mn SOD基因在魁蚶斧足、腮、外套膜、肝胰腺、闭壳肌和血细胞中都有表达,血淋巴细胞中的表达量最高;注射鳗弧菌Vibrio anguillarum后,各组织中Sb Mn SOD基因的表达量显著上调,且表达量均表现出不同程度的滞后性。重组蛋白可以有效地抑制大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和藤黄微球菌(Micrococcus leteus)的生长;且重组蛋白耐高温、耐酸碱。采用RACE技术克隆获得魁蚶铁蛋白(ferritin)基因全长c DNA序列,命名为Sb Fer。序列结构分析表明:c DNA全长930 bp,5’-和3’-UTR分别为182 bp和229 bp;开放阅读框长519 bp,编码一个由172个氨基酸组成的多肽,预测分子量为20.0 k Da,理论等电点5.16。PCR扩增获得魁蚶铁蛋白基因的内含子,间插在4个外显子之间。5’-UTR存在高度保守的铁反应元件。Sb Fer氨基酸序列具有脊椎动物铁蛋白基因的诸多功能序列。同源性分析表明,Sb Fer氨基酸序列与其他软体动物的相似性为63%-96%,与脊椎动物H型铁蛋白的相似性高于L型铁蛋白;系统进化分析表明,Sb Fer与无脊椎动物铁蛋白先聚为一支,再与脊椎动物H型铁蛋白聚类。q RT-PCR结果指出,Sb Fer基因在各组织中均有表达,在血淋巴细胞中的表达量最高;感染鳗弧菌后,Sb Fer基因在各组织中的表达量在除斧足外的其他组织中均显著上调,且具有一定的时间依赖性。重组蛋白的抑菌试验结果指出其可以有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的生长。采用RACE技术获得魁蚶热休克蛋白90(HSP90)基因c DNA全长序列,命名为Sb HSP90。序列和结构分析表明:c DNA全长2707 bp,5’-和3’-UTR长分别为195 bp,325 bp,开放阅读框长2187 bp,编码一个由728个氨基酸组成的多肽,预测分子量为83.72 k Da,理论等电点为4.85。Sb HSP90氨基酸序列含有HSP90家族共有的5个签名序列,ATP酶结构域和C末端高度保守的MEEVD短肽序列。同源性及系统分析表明,Sb HSP90氨基酸序列与软体动物的HSP90氨基酸序列的相似性达到83%以上,与脊椎动物HSP90-α和HSP90-β的同源性很接近。q RT-PCR结果表明:Sb HSP90基因在魁蚶6种组织中均有表达,斧足中的表达量最高,而在肝胰腺中的表达量最低;注射鳗弧菌后,Sb HSP90基因在不同组织中的表达量都显著上调,且具有显著的时间依赖性和瞬时表达趋势。采用RACE技术克隆获得魁蚶半乳糖凝集素(Galectin)基因c DNA全长,命名为Sb Gal。序列和结构分析表明:该c DNA全长3120 bp,5’-和3’-UTR长分别为213 bp、1342 bp,开放阅读框长1565 bp,编码554个氨基酸,预测蛋白的分子量为63.32 k Da,理论等电点为4.99。Sb Gal是一个含有4个糖识别结构域的在双壳贝类中较为独特的半乳糖凝集素。同源性及系统分析表明:Sb Gal氨基酸序列与其他软体动物半乳糖凝集素氨基酸序列的同源性为46%-70%,其四个糖识别结构域彼此的相似性为36%-41%。q RT-PC结果表明:Sb Gal基因在各组织中均有表达,血淋巴细胞中的表达量最高;注射鳗弧菌后,Sb Gal基因在各组织中的表达量都显著上调,且表达具有显著的时间依赖性和瞬时表达趋势,呈现先升高后降低的趋势。