哺乳动物的精子发生是指睾丸内曲细精管基底膜处的一小群精原细胞通过增殖分化、减数分裂及进一步细胞形态变化而形成精子的过程。该过程涉及到细胞生物学、分子生物学中的诸如细胞增殖、分化、凋亡、通讯、减数分裂、基因表达在转录、翻译、翻译后修饰水平的调控等众多重要过程，对这些过程的深入研究将会促进人类对生命规律的进一步认识。 近来的研究表明，人类基因组中大约有4％的基因只在睾丸中特异表达，对这些特异表达基因的功能研究不仅能有助于揭示精子发生这一独特的生命现象，而且还能为研发新一代高效、特异、可逆的男性避孕药提供可能的药靶基因。然而，精子发生机理研究长期以来存在的一个很大障碍是我们几乎没有能够用于体外分子机理研究的生精细胞系或培养方法。可喜的是，近几年来国际上有几个实验室能够将小鼠、大鼠睾丸中分离得到的精原干细胞在体外培养增殖长达半年以上，并且这些干细胞在被移植回动物睾丸中后可以继续增殖、分化形成精子并产生后代。另外，人们可以利用常规的遗传工程手段对这些干细胞进行包括转基因、基因敲除等修饰。这些工作表明了体外培养的精原干细胞是一类具有旺盛的自我更新能力的成体干细胞，这些细胞有望在干细胞的增殖分化机理、睾丸特异表达基因的功能、哺乳动物转基因及基因敲除的应用和理论研究领域开辟一个全新的途径。 在本论文中，我们建立了小鼠DBA/2、ICR、KM(昆明白)三个品系的野生型小鼠精原干细胞的分离、纯化和培养体系，包括SSCs的差异贴壁分选及其在MEF饲养层上的无血清培养。无血清培养基以StemPro-34SFM为基础培养基，添加了GDNF、GFRα1和bFGF等细胞因子和营养成分，SSC可在这一体系中培养和增殖1个月的时间，干细胞克隆的形态特征和SSCs标志分子检测(Thy-1，EP-CAM，c-kit，CD9，GFRα-1，Oct4、c-Ret和NCAM等)结果证明了所培养细胞为SSCs。RT-PCR检测表明SSCs同时表达Oct4和Sox2，说明SSCs与ESCs的增殖调控机制可能有共同点。为从功能上进一步鉴定SSCs，我们建立了精原干细胞移植体系。我们分离培养了转基因(EGFP)小鼠的精原干细胞，以白硝安(40mg/kg体重)处理的8至10周龄的ICR雄性小鼠作为受体，立体解剖镜下将SSCs经睾丸网注入受体小鼠睾丸中，移植2个月后，将受体小鼠与野生型ICR雌鼠合笼。在合笼一个月后，得到了3只通过精原干细胞移植而获得的转EGFP小鼠，荧光显微镜下观察到供体鼠来源的SSCs在受体鼠睾丸曲细精管中产生了生精克隆。这进一步证明了所培养的精原干细胞功能上的完整性和利用精原干细胞移植体系来研究睾丸特异表达基因功能的可行性。 在本课题先前的工作中，我们通过差异显示的方法(DDRT-PCR)在小鼠睾丸中克隆了一个对温度敏感的新基因-Trs4(temperature-relatedsequence4)，该基因CDS全长2369bp，编码789个氨基酸。氨基酸序列分析表明，该基因可能含有一个IQ钙调蛋白结合域和泛素结合域，而且该蛋白保守性很强，从果蝇一直到哺乳动物和人都有相关的同源基因存在。RT-PCR和原位杂交结果显示该基因在睾丸组织中特异性表达，其mRNA主要表达于圆形精子细胞中。免疫组化结果显示，该蛋白开始表达于延长型精子细胞中，在附睾成熟精子中定位在顶体和尾部。 为探索Trs4基因的功能，我们利用酵母双杂交的方法钓取了与Trs4相互作用的蛋白。酵母双杂交试验和体外结合验证试验结果显示Rshl-2，Ddc8和Gstmu1可与Trs4蛋白相互结合。Rshl2(radialspokehead-like2)即放射辅头样蛋白2，广泛存在于真核细胞的纤毛、鞭毛等结构中从而发挥不同的作用，如运动、感觉等。它主要定位于精子尾部，即精子“9+9+2”结构中，它类似“T”型，锚定在外围的“9+9”双微管结构的A-tubule和中间的基丝之间，它通过调节动力蛋白的活性从而维持“9+9+2”结构的完整性和精子的运动。免疫组化显示，Trs4蛋白也定位于精子尾部，推测Trs4可能参与精子的运动。Gstmu1(glutathioneS-transferasemu1)主要催化谷胱甘肽与内源性和外源性的疏水性的亲电子化合物结合，从而降低其毒性，此外它可与一些化学物质如类固醇、甲状腺激素、胆汁和胆红素结合但并不表现催化活性，可能促进它们的转运。考虑到Trs4的表达受温度的影响，推测它可能通过与Gstmu1的相互作用而调节生精细胞内氧在还原状态的平衡。Ddc8为功能未知的基因，RT-PCR、和原位杂交结果显示Ddc8为睾丸特异性表达基因，在小鼠出生后21天可检测到mRNA表达，其表达的细胞类型主要为圆形精子细胞，这与Trs4的表达模式相一致，氨基酸序列分析表明其可能是细胞骨架蛋白。因此，Trs4可能是一种与精子顶体反应和精子运动相关的细胞骨架蛋白。 综上所述，我们为利用体外培养的精原干细胞研究精子发生过程中细胞增殖与分化，特别是生精细胞特异性表达基因在其中的作用做了尝试性的探索工作，主要是建立了精原干细胞的体外培养和睾丸移植技术、利用多种分子生物学技术对一个生精细胞特异表达基因Trs4的表达和功能进行了初步研究。虽然这两个科研手段还未能被有机地结合在一起，但这些工作为我们实现这一目标提供了极为宝贵的经验。