从山东即墨庞裕水产养殖公司患病的大菱鲆体内分离到一株病原菌 SMP1，经人工感染试验计算出 SMP1 的半致死量 LD50＝1.94×106 CFU/per fish。药敏实验表明氟哌酸、丙氟哌酸、复合磺胺、氯霉素、四环素对 SMP1 有较强的抑制作用。BIOLOG 细菌鉴定系统不能对 SMP1 鉴定。SMP1 革兰氏染色阴性，弯杆状，可运动，电镜下观察有一根很长的极生单鞭毛。SMP1 的 16S rDNA 序列与鳗弧菌有最大的相似性。以 SMP1 为模板，用扩增鳗弧菌溶血素基因保守区的引物进行 PCR，扩增的产物的大小和序列均与鳗弧菌的一致。综合形态观察、生理生化特征、16SrDNA、溶血素基因保守区分析等实验结果，可将 SMP1 鉴定为鳗弧菌。 在许多弧菌属的细菌中，溶血素是一种重要的毒力因子，但是关于鳗弧菌的溶血素的研究还很不充分。用已发表的血清型为 A 的鳗弧菌 PT84057 的序列设计引物，没有扩增出鳗弧菌 M3 的溶血素基因。为了得到鳗弧菌 M3 溶血素基因，首先根据鳗弧菌 PT84057 溶血素保守区序列设计引物，用反向 PCR 及巢式 PCR 得到了 5‘上游和大部分编码区序列。随后，将鳗弧菌 M3 基因组酶切，加上接头，构建基因组文库，根据巢式 PCR 结果设计引物，进行 PCR，产物与巢式 PCR 产物比对，拼接出完整的溶血素基因序列。与鳗弧菌 PT84057 的溶血素基因比较发现，二者的编码区在 3‘末端的 82 个碱基序列不一致。翻译后在网上比对，发现鳗弧菌 M3 溶血素氨基酸序列与鳗弧菌 PT84057 溶血素氨基酸序列相似性最高，有 84％的一致性，并且鳗弧菌 M3的溶血素氨基酸数目比鳗弧菌 PT84057的少 11个。 为了研究溶血素基因对鳗弧菌 M3 致病力的贡献，将溶血素基因的保守区克隆入自杀质粒载体 pNQ705 中，通过接合供体菌 SY17-1 与野生型鳗弧菌 M3 接合后导入重组质粒，经过等位基因置换使溶血素基因插入失活。PCR 检测和测序结果都表明已成功地构建了鳗弧菌溶血素基因突变株。该突变株胞外产物 SDS－PAGE 图谱与野生型图谱没有显著差异，也能在血平板上溶血，对金鱼的毒力与野生型比较，没有显著下降。 1<WP=6>中科院研究生论文 大菱鲆致病菌的分离鉴定和溶血素基因的克隆、突变和表达 鉴于宿主中的病原体的存活和复制能力常常依赖于多种基因的协同表达，缺失了某个毒素的菌株仍有可能具有致病性，以及为了更好地研究溶血素的作用机制，本文将溶血素基因克隆入表达载体 pET24a 中，在 BL21（DE3）宿主中进行诱导表达。结果发现，溶血素基因主要以包涵体的形式表达在胞内，可溶性蛋白的比例占的不是很大，分泌到胞外的表达的蛋白量很小。当 IPTG 的终浓度是 0.1mM，诱导的时间为 13 hr，诱导的温度为 28℃时，胞内可溶性蛋白的表达量较高。用细胞破碎后的上清与鲫鱼的红细胞一起温育，50 min 后，鲫鱼的红细胞出现明显裂解现象。利用蛋白的组氨酸标签与 NTA-Ni 树脂的亲和力，对蛋白进行纯化，结果发现，在非变性条件下，蛋白难以吸附到树脂上，而在变性条件下蛋白的纯化则较易进行。 本研究在重组表达载体的构建时，将 N-端原则中认为使表达的蛋白最不稳定的N－端第二个氨基酸－亮氨酸，改为谷氨酰胺，结果发现，序列改后的表达的蛋白与未改动的原来的蛋白的稳定性没有显著差别。