第一部分AngⅡ-p22phox-ROS信号通路对大鼠高氧性肺损伤的调控背景越来越多的新生儿特别是早产儿接受氧疗和机械通气治疗,直接导致急慢性高氧肺损伤发生率的增高,严重影响患儿的肺功能和肺发育,经更换机械通气模式、激素、表面活性物质替代疗法、免疫疗法等方面的尝试均收效甚微。近年来,AngII-p22phox-ROS（血管紧张素II-细胞色素b245-活性氧）信号通路参与血管重塑、影响器官纤维化的作用引人注目。本实验选择不同年龄SD大鼠为研究对象,建立高氧肺损伤动物模型,探索肺AngII-p22phox-ROS信号通路在高氧条件下肺内的变化规律及调控AngII对高氧肺损伤的影响,明确PPARγ因子（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）和主动修复基因hOGG₁（人类8_羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶）在肺损伤的修复中的地位和作用。目的利用新生大鼠肺泡化进程与人类新生儿相似这一特点,成功建立高氧肺损伤动物模型,利用形态学、分子生物学技术方法,拟解决①AngII-p22phox-ROS通路各指标表达水平与高氧肺损伤程度是否存在时空依存;②拮抗AngII可否激活细胞内PPARγ以多信号途径减轻高氧肺损伤病变;③hOGG₁基因的表达水平是否与受损细胞主动修复能力密切相关并最终对预后产生影响。方法新生SD大鼠（日龄3天足月鼠）90只,随机分为新生空气组（A组）、新生高氧组（B组）、新生干预组（C组）,每组各30只,另取成年大鼠（日龄90天）30只为成年高氧组（D组）。新生高氧组、成年高氧组、新生干预组大鼠（新生大鼠5-8只独立分笼配一只代母鼠）,生后即置于有高氧培养氧舱内持续吸入在90%±2%高浓度氧气建立高氧模型,新生空气组吸入空气,其余实验因素同模型组。新生干预组于高氧暴露开始后,连续7d尾静脉注射糜蛋白酶抑制剂NK3201 5mg/kg/d。每组分别于实验开始后的第1、3、7、14、21d随机选取6只大鼠,处死后肺部充分灌洗,左肺分别用4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定制片,苏木素-伊红染色后观察肺形态变化,其余送检透射电镜。右肺组织-80℃冷冻保存待测。每日记录大鼠的反应指标和生存率以评估高氧对大鼠一般情况的影响。HE和电镜送检分别观察一般形态学和超微结构变化。放射免疫法测定肺组织AngII含量;RT-PCR法测定肺组织AT1R（血管紧张素1型受体）、p22phox mRNA（细胞色素b245）表达水平; DCFH-DA法测定肺组织ROS含量;TUNEL法和SABC法测定肺组织内细胞凋亡情况;Western Blot法检测hOGG₁、PPARγ蛋白表达水平。结果1.新生高氧组大鼠出现从活力下降到高氧依赖等一系列改变,随着高氧暴露时间的延长死亡率增多,新生干预组相比改变程度有减轻,成年组仅有呼吸增快和活动力下降,未见死亡发生。新生空气组状态良好。光镜和电镜下大鼠形态学改变显示一致性:顺序出现肺充血、中性粒细胞侵润、肺泡间质水肿等改变、肺泡II型上皮细胞（AT-II）不同程度凋亡,后期出现纤维化倾向,显示高氧动物模型建立成功。2.高氧可引起各组AngII、AT1R、p22phox mRNA增高,AngII和p22phox mRNA在14d达到高峰后逐步下降,AT1R保持小幅增加。糜蛋白抑制剂可显著下调AgII、p22phox mRNA、AT1R的表达（P<0.05）。与AngII在大鼠肺内情况刚好相反,新生高氧组AT1R和p22phox mRNA表达水平均高于成年组相应时间点水平,因此推测,肺内p22phox可能受AngII和AT1R的共同调控。单因素相关分显示肺内ROS指标的高低与AngII、p22phox mRNA、AT1R呈正相关(r=0.775, P<0.01;r=0.838, P<0.01;r=0.712,P<0.05=。TUNEL和caspase-3的变化规律表现出随ROS水平增高而增高的趋势,以上三种指标的增幅新生高氧组均较成年高氧组增高（P<0.05）。3.新生空气组大鼠hOGG₁、PPARγ蛋白表达保持稳定低表达,高氧引起各高氧组hOGG₁和PPARγ蛋白表达的迅速增高,但高峰出现时间早,持续时间短,表达水平低,并迅速下降。与新生高氧组大鼠相比,成年高氧组的hOGG₁、PPARγ蛋白表达水平较高,高峰持续时间较长。新生干预组虽未能完全阻止高氧肺损伤的发生,但与新生高氧组相比,肺内ROS水平、凋亡指数AI、caspase-3水平有明显下降（P<0.05）,hOGG₁、PPARγ的最高峰值分别增达461.59±0.41和604.49±1.77（IOD）,较新生高氧组的288.66±0.51和424.11±0.19（IOD）,增幅分别达到23.01%和28.90%（P<0.05）。结论1.一般表现结合死亡率和肺部形态学指标,证实大鼠高氧肺损伤动物模型立成功。2.持续高氧暴露可明显上调肺部AngII水平,引起AngII-p22phox-ROS信号通路下游相应改变,变化程度和时间顺序与肺组织形态学改变一致,提示RAS（血管紧张素系统）参与了高氧肺损伤,是后期肺纤维化发生发展的机制之一。3.新生高氧组大鼠肺组织AT1R水平明显高于成年高氧组,这可能是其在AngII水平较低的情况下,p22phox mRNA和ROS水平仍然高于成年高氧组且肺损伤较明显的原因之一。4.修复相关基因PPARγ和hOGG₁上调能力受限可能是高氧性肺损伤自我修复不全引起后期肺病变的原因之一。5.糜蛋白抑制剂NK3201可有效抑制AngII的产生,减少ROS的产生,提升PPARγ和hOGG₁的表达,增强肺内功能细胞主动修复能力,使避免凋亡得以发挥肺内干细胞的主动修复作用。第二部分主动修复基因hOGG₁高表达A549细胞的构建及生物学特性的鉴定背景由于AT-Ⅱ是肺泡上皮损伤修复的唯一途径,而氧化和抗氧化状态失衡造成的DNA损伤,是AT-Ⅱ凋亡最终导致高氧肺损伤肺纤维化的主因之一,因此,只有增加细胞抵抗氧化损伤的能力,促进受损DNA的主动修复,AT-Ⅱ才能避免调亡得以发挥肺内干细胞的主动修复作用。因此,本研究试图建立主动修复基因高表达的细胞株,进一步应用于高氧肺损伤主动修复能力的研究,探索改善高氧肺损伤预后的方法。目的通过质粒抽提纯化技术制备真核质粒pcDNA3.1（+）/Myc His A,采用RT-PCR技术扩增hOGG₁全长基因,单方向插入pcDNA3.1（+）/Myc His A,继而成功构建真核表达载体pcDNA3.1（+）/MycHis A-hOGG₁,后结合荧光酶报告基因PGL3 promoter稳定转染至人肺腺癌A549细胞,建立hOGG₁高表达细胞株并鉴定其生物学特性,为进一步研究hOGG₁高表达对DNA氧化损伤修复能力的影响提供生物学手段。方法参考Gen Bank中登录的hOGG₁基因的cDNA序列（NM₀16821.2）设计扩增全长引物。大肠杆菌E.coli DH5a作为感受态细胞,经常规制备、转化、扩增后提取质粒。紫外分光光度计测定溶液的吸光度值确定抽提质粒的浓度,UVI凝胶成像系统观察电泳结果确定质粒完整性。利用限制性核酸内切酶EcoRI/KpnI反应体系对hOGG₁基因与pcDNA3.1（+）/Myc-His A进行酶切鉴定后, DNA连接酶连接pcDN3.1（+）/ Myc-His A和hOGG₁基因双酶切产物。连接产物转化新鲜制备的感受态细胞,用含有AMP（终浓度10μl/ml）的LB平板筛选阳性菌落。肉眼观察重组子形态学变化,随即挑取4个菌落, mini prep双酶切试剂盒,抽提连接的质粒进行反应酶切,酶切产物电泳鉴定,并经PCR扩增后进行DNA测序分析。取A549细胞随机分为空白对照组（A549）、阴性对照组（A549-P）和转染组（A549-T）。酶切鉴定后,A549-T按9:1比例配置pcDN3.1（+）/Myc-His A-hOGG₁和pGL3 promoter,加入polyfection和无血清DMEM ,37℃、95%湿度、5%CO2继续培养转染并筛选稳定转染的A549细胞,A549-P组加入pGL3和pcDN3.1（+）/Myc-His A空质粒。分别于1、2、3、4、5d随机挑选两组细胞稳定转染阳性克隆,经Luciferase Assay System检测荧光素酶活性（空白对照组荧光值作为背景值）,Western Blot检测hOGG₁蛋白的表达,鉴定hOGG₁基因高表达细胞株建立成功。随机选取空白对照组A549细胞、阴性对照组A549-P细胞、转染组A549-T细胞,鉴定三组细胞的生物学特性,方法包括:Olympus倒置相差显微镜摄像系统观察三种细胞生长形态并采集图像;MTT比色法观察细胞生长速度连续7d后绘制生长曲线;流式细胞仪检测检测细胞周期变化。结果1.实验成功地扩增出全长1200 bp左右的hOGG₁编码序列,电泳结果显示与预计的大小基本吻合。2.酶切PCR扩增后产物和载体,凝胶电泳确认二者长度（hOGG₁为1200bp,pcDNA3.1（+）/Myc-His A为5346bp ,均与估计大小基本一致）。三段序列测序报告显示:CMVF（TH1-5）CMVR（TH2-5）和TH1-3209,拼接的为hOGG₁全序列。3.荧光显微镜下挑选转染成功细胞克隆（PGL3无抗生素拮抗基因,有荧光表达提示共转染成功）,G418筛选出稳定转染的阳性细胞克隆继续培养。随即提取生长完全的克隆分别进行hOGG₁基因表达水平的测试:转染组荧光素酶活性达到1.305±1.88（RLU×105）,阴性对照组为1.311±3.95（RLU×105）,与空白对照组的0.034±3.37（RLU×105）相比增高显著（P<0.01）,提示双质粒插入细胞DNA序列并在CMV启动子的强效启动下高水平复制。Western Blot法检测hOGG₁蛋白表达水平,转染组达到485.37±0.21（IOD）,空白对照组、阴性对照组分别为147.35±2.04 （IOD）,159.41±4.37（IOD）,组间比较统计学差异明显（P<0.05 & P<0.01）,提示转染组细胞hOGG₁基因成功增高表达,hOGG₁基因高表达A549细胞株建立成功。4.MTT法测定细胞生长曲线和倍增时间,流式细胞仪测定细胞周期变化,荧光相差显微镜观察细胞克隆形态,未发现三组细胞之间有明显的统计学差异,提示基因转染过程未对细胞本身的生物学特性造成影响,可作为有效生物学工具应用于下一步实验之中。结论1.实验通过在质粒中加入不同的酶切位点KpnI和EcoRI,确保了目的片段hOGG₁的单方向插入,真核质粒pcDNA3.1（+）/Myc-His A-hOGG₁构建成功。2.携带荧光素酶的报告基因PGL3 promoter,具有敏感性高、相关性强、筛选直观性好的特点,克服了既往阳性克隆筛选时间长精度低的瓶颈,是国际上流行的荧光酶报告基因。由于PGL3无抗生素拮抗基因,有荧光表达提示联合pcDNA3.1（+）/Myc-His A进行的共转染,成功,pGL3的荧光素酶活性可正确指示转染目的基因表达水平。3.两个转染组细胞（A549-P、A549-T）hOGG₁目的蛋白表达水平增高,空白对照组和阴性对照组之间无统计学差异（P>0.05）,提示表达增高与质粒pcDNA3.1（+）/Myc-His A本身无关,hOGG₁基因高表达A549细胞构建成功。4.通过生长速度、形态学检测、细胞周期检测等各种鉴定手段,未发现细胞转染后有明显的生物学特性改变。以上构建的成功,为下一步深入研究DNA氧化损伤和修复提供了一个十分有效的生物学工具。第三部分hOGG₁基因高表达细胞株对高氧诱导的DNA氧化损伤及修复效应的影响方法取由本实验室保存的A549原代细胞,和本室前期试验完成的hOGG₁基因高表达细胞株,设立对照组（A549）、转染组（PGL3 + pcDNA3.1（+） /Myc-HisA-hOGG₁ A549-T）。每组内部再分为时间组和浓度组。时间组细胞培养基暴露于90%高氧环境中,并分别于0h（自身空白对照）、12h、24h、48h收集标本检测分析。浓度组细胞置于50%、60%、80%、90%氧气浓度的高氧培养箱,保持37℃,95%湿度,培养24h。取部分90%高氧浓度暴露24h和48h细胞,高氧处理完毕后置含小牛血清完全培养液37℃继续培养,分别于0、60、120和180 min取出细胞,离心收集后待检。受试细胞分别送检一般形态学观察和超微结构的观察,细胞凋亡和细胞周期变化的观察:流式细胞Annexin V/PI法检测凋亡,FSC筛选,FL2-H检测细胞周期变化。Western Blot检测细胞凋亡相关指标PPAR-γ、Bcl-2、Caspase3。改良彗星实验检测两组细胞对高氧诱导的DNA损伤和主动修复能力的比较。结果1.形态改变:高氧暴露可造成两组细胞一般形态和超微结构的损伤性改变,程度随高氧浓度的增加和高氧暴露时间的延长逐步加重。转染组较对照组形态变化明显轻微。2.细胞凋亡和周期变化的比较:高氧可诱导细胞凋亡的发生,凋亡细胞比例与高氧时间及环境氧浓度成正相关。与对照组相应条件相比, A549-T细胞凋亡比率明显下降（P<0.05,部分指标P<0.01）。高氧暴露后,两组细胞不同程度出现了G0G1期细胞比例增多,S期细胞比例减少的“细胞周期阻滞”现象,细胞分裂因此受阻。与对照组相比, A549-T细胞的G0G1期细胞比例降低、S期细胞比例增高（P<0.05）,提示其对氧化损伤诱导的DNA损伤和周期阻滞有明确的对抗作用。3.细胞凋亡相关指标: PPARγ、Caspase3和Bcl-2三种凋亡相关蛋白表达水平表现不同的变化趋势。PPARγ蛋白的表达呈现逐步下降的趋势,而Caspase3蛋白的表达则先增加后降低,分别于高氧暴露24h和氧气浓度达到90%时表达水平到达高峰。Bcl-2蛋白表达则表现出相反变化,即随着高氧暴露时间和暴露环境氧气浓度的增加而逐步增高。A549-T细胞以上三种指标的变化趋势基本相同。其中,PPARγ蛋白表达水平明显高于对照组（P<0.05&P<0.01）,而Caspase3蛋白和Bcl-2的表达水平较两个对照组明显降低（P<0.05&P<0.01）。4. DNA的损伤和修复各种细胞拖尾率和彗星尾矩（Olive Tail Moment,TM）均随高氧暴露时间的增加而增加,提示DNA损伤发生。高氧暴露24h时,对照组尾矩达到19.3±3.95,与A549-T细胞组的8.90±1.88相比有明显增大（P<0.05）。显微镜下可见彗星细胞头部由圆形强荧光到点状弱荧光,而尾部渐增大,荧光由弱到强,相较之下,转染组细胞（A549-T）变化明显轻微。60 min时A549-T细胞可观察到有统计学意义的修复,而在对照组却延迟到120 min,且A549-T细胞可以完全修复不同时间高氧暴露诱导的DNA损伤,而对照组最终有7%的损伤细胞最终不能完成修复,当暴露时间延长到48h以上时,其未能完成修复的细胞比例高达40%。结论1.高氧除了直接引起细胞凋亡,还通过对细胞周期的阻断,影响肺泡上皮分裂增殖,阻碍自我修复过程。2. PPARγ、Caspase3和Bcl-2表达水平的变化与细胞凋亡之间关系密切,但变化规律和作用机制迥然不同。3. A549-T细胞对抗高氧损伤的能力明显增强,对高氧诱导的DNA损伤有着比A549细胞更强、更快、更完全的修复能力。4. hOGG₁基因高表达是转染组细胞抗损修复能力提高的原因,有效提升细胞抗损修复能力可阻止相关病理过程的发生,改善最终预后。