论文部分内容阅读
研究背景：脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCS）在2001年被Zuk等于脂肪组织中提取。而后发现在不同培养基作用下，可诱导ADSCs向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、神经细胞、肝细胞、胰岛细胞等分化，上述研究表明ADSCs还具有跨胚层、跨系分化的潜能。ADSCs具有以下优点：①储量丰富，来源充足；②获取方法简单；③脂肪组织中干细胞含量丰富；④脂肪干细胞增殖能力强，多次传代遗传性状仍稳定；⑤属自体移植，无排斥反应。因此脂肪干细胞作为组织工程的种子细胞越来越受到关注。自体脂肪移植目前广泛应用于整形外科，但是其成活率低，导致需要多次手术或产生多种并发症，使其成为整形外科急需解决的问题。我们在细胞实验及动物实验中证明富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP)可以提高脂肪移植的成活率，但是其主要作用机制尚不十分明确。Wnt3基因和Klotho基因是干细胞增殖的相关基因，可能与提高脂肪移植成活率有关，因此本实验中，我们向ADSCs中加入PRP，对这两种基因的启动情况进行研究。目的：研究自体富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP)对兔来源脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCS）Wnt3基因和Klotho基因启动情况的影响。方法：脂肪干细胞提取自新西兰大白兔附睾脂肪组织，采用形态学及诱导分化进行细胞鉴定后，将细胞培养至第四代，取新西兰大白兔腹主动脉血通过传统二次离心法制备富血小板血浆PRP（platelet-rich plasma）、贫血小板血浆PPP（platelet-poor plasma），将脂肪干细胞在含PRP（实验组）、PPP（对照组）及空白全培（空白组）各5%的培养液中分别培养24小时、48小时、72小时，将各组细胞裂解提取总RNA，通过RT-PCR查看两种目的基因Wnt3基因和Klotho基因表达情况。结果：1.原代兔脂肪干细胞早期为椭圆形，25cm2培养瓶中培养4-6小时后细胞开始贴壁，逐渐变为长梭形，8-10小时后80%椭圆形细胞贴壁，随着细胞增殖，呈梭形漩涡状生长；经过3-4次传代培养后，细胞基本得到纯化，倒置显微镜下，形态学符合干细胞形态特征。2.分别向成脂、成骨诱导分化后用油红O染色和茜素红染色，均能成功着色，证实为脂肪细胞和骨细胞，证明了此种细胞具有多向诱导分化能力。3.RT-PCR结果显示实验组Wnt3基因和Klotho基因量明显增多。结论：通过分离、体外培养所得的细胞经形态学和多向诱导分化鉴定，确定为兔来源脂肪间充质干细胞。PRP可促进兔脂肪干细胞增殖并明显提高Wnt3基因和Klotho基因的表达。