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CRISPR-Cas9系统是原核生物抵御病毒或质粒等外来遗传物质入侵的一种获得性免疫系统,主要由非特异性Cas9核酸酶和起识别作用的crRNA组成。该系统自2012年首次证明可以在体外对DNA进行基因编辑,现已成功地应用于不同物种的基因编辑中。作为一种新型的基因编辑技术,该技术具有简单、快速、高效等优点。目前该技术已成功的应用于多种物种的基因敲除、gRNA文库的建立及动物疾病模型的构建等。骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)是骨基质中一种高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白,在肿瘤的粘附、增殖、侵袭、基质降解、免疫反应(炎症和补体逃逸)、血管生成等转移相关的多个过程中发挥重要作用。自1994年Bellahcene首次证实BSP表达与乳腺癌骨转移相关,有关乳腺癌骨转移与BSP的关系研究取得了明显进展。目前相关研究报道中抑制BSP表达的方法包括反义核酸、BSP抗体及RNA干扰技术,但都只是在转录后或翻译水平不同程度地暂时降低BSP的表达。因此,本研究拟利用CRISPR-Cas9技术,在转录水平抑制亲骨转移乳腺癌细胞(231BO)的BSP基因表达,通过细胞增殖、克隆形成和细胞划痕实验初步检测细胞生物学性质变化,为进一步研究BSP与乳腺癌骨转移关系的分子机制提供实验依据。本实验的主要研究结果如下:1.成功构建表达Cas9蛋白的亲骨转移乳腺癌细胞(231BO-Cas9)。通过流式细胞术、Western blot、免疫细胞化学检测证实231BO-Cas9细胞表达Cas9蛋白,并且在核定位信号的引导下能够进入到细胞核中。2.实时无标记动态细胞分析和划痕实验结果表明Cas9蛋白的表达对乳腺癌细胞的增殖和迁移均无影响;电镜观察发现231BO-Cas9与231BO细胞的细胞膜、细胞器及细胞核的结构一致,提示Cas9蛋白表达对乳腺癌细胞超微结构无影响。3.SURVEYOR检测和基因测序结果表明针对BSP的gRNA能够介导Cas9蛋白对靶位点进行切割,造成BSP基因的插入缺失突变,提示231BO-Cas9细胞表达的Cas9蛋白能够进入到细胞核中并发挥核酸内切酶的作用。4.利用CRISPR-Cas9技术获得2株BSP蛋白表达下降乳腺癌细胞株(231BO-Cas9-gRNA)。与对照组细胞相比,western blot结果显示2株231BO-Cas9-gRNA细胞BSP表达下降分别为34.5%和36.7%;通过CCK-8检测发现231BO-Cas9-gRNA细胞增殖能力下降,细胞划痕实验提示231BO-Cas9-gRNA细胞的愈合速度分别降低28%和32.9%;克隆形成实验显示231BO-Cas9-gRNA细胞的克隆形成能力分别降低32.3%和37.2%。实验结果表明CRISPR-Cas9介导BSP基因编辑引起BSP蛋白表达水平下调后,亲骨转移乳腺癌细胞的增殖、迁移及克隆形成能力均有所下降。