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目的:骨关节炎是最为常见的慢性退行性关节疾病,好发于老年人。随着社会经济的发展,人们生活水平的提高,我国肥胖人口越来越多,而肥胖是导致骨关节炎发生发展的重要原因,所以我国骨关节炎患病率不断攀升,据统计目前我国的骨关节炎患病率约为15%。庞大的患病人群,给家庭和国家带来了沉重的负担,骨关节炎的防治已经成为我国医疗卫生的重大挑战。然而,骨关节炎的发病机制迄今仍未阐明,也没有能够彻底治愈骨关节炎的特效药物,因此揭示骨关节炎的发病机制,寻找新的安全高效的治疗药物成为了目前防治骨关节炎的重中之重。蜂针作为中医传统特色疗法,简便低廉,对于风湿、类风湿、骨关节炎等关节疾病有着显著疗效,目前在中医临床上正越发受到重视。然而,目前关于蜂针蜂毒的基础研究不多,蜂针治疗关节疾病的原理和机制尚未阐明,所以本实验选用碘乙酸钠诱导关节炎大鼠模型,复制骨关节炎的发病机制,通过以蜂针为主要干预手段的动物实验,观察蜂毒对碘乙酸钠诱导关节炎大鼠膝关节软骨细胞自噬和凋亡平衡的影响,初步探讨蜂毒治疗骨关节炎的作用机制。方法:将80只雌性SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组组、蜂毒高剂量组、蜂毒中剂量组、蜂毒低剂量组、针刺组、盐酸氨基葡萄糖组、NF-κB拮抗剂组,每组10只。除空白对照组外,其余组大鼠均采用右膝关节腔注射碘乙酸钠的方法诱导建立大鼠骨关节炎（KOA）模型。注射碘乙酸钠时,于大鼠右膝关节髌骨下方稍内侧进针,针尖向中上倾斜穿刺进入关节腔内,缓慢将碘乙酸钠溶液注入关节腔中。成功造模后,空白对照组组和模型对照组组大鼠不予处理。蜂毒低剂量组、蜂毒中剂量组以及蜂毒高剂量组大鼠均采用活蜂蛰刺的方法进行干预,每3天1次。其中低剂量组大鼠每次每只消耗1只活蜂,蛰刺部位为右膝关节髌骨下缘内侧,中剂量组大鼠每次每只消耗2只活蜂,蛰刺部位为右膝关节髌骨下缘内侧和外侧,高剂量组大鼠每次每只消耗4只活蜂,蛰刺部位分别为右膝关节髌骨下缘内侧和外侧以及髌骨上缘内侧和外侧。针刺组大鼠采用掀针针刺的方式进行干预,每次每只大鼠各2针,每3天1次,针刺部位为右膝关节髌骨下缘内侧和外侧。盐酸氨基葡萄糖组大鼠每天灌胃2次,每次药物用量为67.5mg/kg。NF-κB拮抗剂组大鼠分别在右下肢大腿外侧肌注NF-κB拮抗剂,剂量为10mg/kg,每3天肌注1次。以上各组大鼠均连续干预6周,6周末最后一次干预结束后,隔天处死所有大鼠。实验干预期间,记录各组大鼠体重、关节炎指数、机械疼痛阈值变化,每周一次。实验结束后,麻醉处死所有大鼠,同时采集大鼠腹腔动脉血,抽取大鼠右膝关节的关节液,截取各大鼠右膝关节,并用4%多聚甲醛固定。用酶联免疫分析法分别检测各组大鼠血清和关节液中炎症因子TNF-α、IL-1β浓度。4%多聚甲醛固定后的大鼠右膝关节制备石蜡切片,分别对软骨组织和关节滑膜组织进行HE染色,观察两部分组织的病理表现,进行关节炎评分。另外取软骨组织切片,用免疫组化法检测软骨组织中自噬和凋亡相关蛋白的表达,评估软骨细胞自噬和凋亡的水平,用免疫荧光法检测NF-κB核转运水平。结果:关节腔注射碘乙酸钠诱导造模2周后,大鼠右膝关节出现不同程度红肿、疼痛,大鼠机械疼痛阈值降低,随机处死两只大鼠,打开右膝关节腔,发现关节软骨出现肉眼可见的轻微腐蚀,大鼠KOA模型成功建立。用不同手段实验干预6周后,各组大鼠体重变化无明显差异,各治疗组大鼠的机械疼痛阈值不同程度升高,其中蜂毒高剂量组最为明显,模型对照组的机械疼痛阈值则持续降低。6周后,不同治疗组大鼠的关节炎症状也得到不同程度的缓解。关节炎评分结果显示,NF-κB拮抗剂组、针刺组以及盐酸氨基葡萄糖组大鼠的关节炎症状和模型对照组相比没有明显减轻（P>0.05）。另外,三个不同剂量的蜂毒组中,只有高剂量组大鼠的评分结果显著低于模型对照组,中剂量和低剂量组大鼠的关节炎症状也没有显著减轻。ELISA检测结果显示,各实验组关节液和血清炎症因子IL-1β、TNF-α相互之间没有显著差异（P>0.05）,血清中IL-1β的浓度都显著高于关节液（P<0.05）。HE染色发现,在碘乙酸钠诱导下,造模组大鼠出现明显的软骨基质降解以及软骨组织丢失。治疗6周后,蜂毒减轻了软骨细胞和软骨基质的丢失,以蜂毒高剂量组最为明显。免疫组化结果显示,和正常大鼠相比,实验大鼠软骨组织中Bax的表达明显增加,其中模型对照组大鼠最为明显。蜂毒组大鼠软骨中组织Bax的表达较模型对照组少,蜂毒中剂量组和高剂量组比低剂量组明显。Bcl-2在正常软骨组织中呈高表达,但注射碘乙酸钠后,Bcl-2的表达明显减少。治疗结束后,Bcl-2在各实验组大鼠中的表达均增加。无论是空白对照组大鼠还是实验组大鼠中,caspase3都没有明显表达。正常软骨组织中,Beclin1、LC3-b和p62都有较高的表达水平。各实验组中Beclin1、LC3-b和p62的表达明显低于空白对照组。蜂毒组中Beclin1、LC3-b和p62的表达高于模型对照组,且蜂毒中剂量组和高剂量组比低剂量组明显。免疫荧光结果显示,NF-κB信号通路在各实验组大鼠软骨细胞中均呈激活状态。结论:蜂针具有明显的抗炎镇痛作用,可明显减轻KOA大鼠的关节炎症和和滑膜炎症,降低关节炎指数,改善关节软骨损伤。蜂毒可以促进软骨细胞自噬,抑制软骨细胞凋亡,从而缓解KOA的病理进展,与软骨细胞和滑膜细胞中的NF-κB信号通路激活相关。蜂针的疗效优于盐酸氨基葡萄糖、NF-κB拮抗剂及毫针刺,且具有剂量依赖效应,蜂毒高剂量组的疗效明显优于蜂毒中剂量组和蜂毒低剂量组。此外,实验结果显示,针刺组没有表现出明显的治疗效果,由此可见,蜂针治疗KOA由蜂毒起主要治疗作用。