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在兔中性粒细胞中存在大量低分子量的阳离子抗菌肽,这些抗菌肽来自同一个基因家族,属于α防御素。其中NP-1由33个氨基酸组成,含有3个分子内二硫键,对G+、G-,真菌及带衣壳病毒都有抑菌活性,还能抑制HIV病毒的复制,是α防御素家族中抗菌谱最广、抗菌活性最强的一种防御素。
本论文主要研究了NP-1基因在原核及真核表达系统中的基本表达策略及抑菌机理。在大肠杆菌表达系统中,运用pET-32(a)+载体在BL21(DE3)溶原菌中进行NP-1的融合表达,融合蛋白表达量达到90.93 mg/L,其中99%为可溶性蛋白。融合蛋白经肠激酶酶切后,得到有抑菌活性的重组NP-1。实验表明,Trx融合标签蛋白对提高NP-1融合蛋白的表达量及其可溶性,保持NP-1的生物活性有极其重要的作用。同时,本文也探讨了抗生素浓度、诱导时间、IPTG浓度及培养基对NP-1基因表达量的影响,结果表明,在Amp浓度为25μg/mL、IPTG浓度为0.1mmol/L、使用LB培养基诱导培养3h,NP-1基因融合蛋白的表达量最高。
在毕氏酵母表达系统中,本研究应用pPICZα-A载体进行NP-1基因及其多串联基因的分泌表达,其表达量分别为 3.39μg/mL(pNP-1)、6.39μg/mL[pNP-1(2×)]、13.05μg/mL[pNP-1(3×)],多价串联体的重组蛋白经溴化氰切割,得到有抑菌活性的产物。抑菌实验显示,重组NP-1对G+(苏云金杆菌,金黄葡萄球菌,枯草杆菌)及G-(大肠杆菌K12D31)都有抑菌活性,其MIC分别为10.63μg/mL、8.59μg/mL、8.13μ/mL及8.46μg/mL。重组NP-1对真菌没有明显的抑菌活性。
对NP-1的抑菌机理进行了研究,发现细胞壁合成抑制剂和DNA合成抑制剂的处理菌对NP-1敏感性增大,而多种蛋白质合成抑制剂和RNA合成抑制剂的处理菌对NP-1的敏感性下降。这种现象提示NP-1的抑菌过程不仅涉及肽与细菌细胞膜的作用,更有可能参与了对细菌蛋白质合成及核酸合成的抑制。NP-1可能先与靶细胞膜相互作用,增加膜的通透性,之后进入细菌细胞内部,与DNA结合,使之片段化,同时与核糖体RNA或蛋白质合成相关的酶作用,从而抑制蛋白质合成,达到抑制细菌生长的目的。