乳腺癌死亡率在全世界女性肿瘤相关死亡病因中居第一位。尽管ARHI基因与Ras原癌基因具有54%-59%的同源性,它在功能上属于印迹抑癌基因。卵巢癌中ARHI再表达可诱导体外细胞自噬型死亡,但是在肿瘤微环境因素影响下ARH临裸鼠移植瘤内再表达使细胞维持于休眠状态。紫杉醇是一种微管微丝抑制剂,使细胞周期停滞并且诱导细胞凋亡,临床试验证实它显著提高乳腺癌患者无病生存期和总生存期,已经作为乳腺癌一线化疗药物。探索乳腺癌中ARHI再表达诱导的自噬和紫杉醇导致的凋亡两种细胞死亡途径结合发挥抑瘤作用的机制,为将来的临床应用提供有意义的实验依据。目的：本课题探索ARHI在乳腺癌中再表达能否诱导细胞自噬型死亡,能否增强化疗药物紫杉醇对乳腺癌细胞生长的抑制作用,并且探索联合抑制作用的机制。方法：(1)体外采用去甲基化剂DAC和/或去乙酰化酶抑制剂TSA等表观遗传修饰方法活化乳腺癌细胞MDA-MB-231和SKBr3中内源性ARHI基因,或脂质体导入ARHI表达质粒,使ARHI在体内体外细胞中再表达。SYBR-Green实时荧光定量RT-PCR法检测ARHI mRNA表达,Western blot法检测ARHI蛋白表达。(2)丫啶橙染色流式细胞仪检测酸性囊泡(AVO),定量分析细胞自噬率。GFP-LC3质粒和pcDNA3-ARHI质粒共同转染SKBr3细胞,荧光显微镜观察自噬小体,计算自噬细胞比率。Western blot检测细胞自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达。(3) SRB法检测药物TSA和紫杉醇对乳腺癌细胞增殖的联合作用。(4)动物实验观察ARHI再表达以及联合紫杉醇对肿瘤生长的影响。将MDA-MB-231细胞注射至裸小鼠乳腺脂肪垫内,建立乳腺癌移植瘤裸鼠模型。随机分组后给药如下,ARHI基因治疗组以脂质体包裹pcDNA3-ARHI表达质粒(5μg/50μg/次)瘤内注射导入肿瘤,紫杉醇治疗组以10mg/kg/次尾静脉注射,联合组用脂质体pcDNA3-ARHI瘤内注射联合紫杉醇静脉注射。设置生理盐水、空载体质粒、脂质体对照组。测定肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,计算及比较各组肿瘤生长抑制率。待对照组肿瘤平均直径达1.5cm时结束实验,切下肿瘤组织行透射扫描电镜观察肿瘤中细胞自噬和凋亡现象,低温冻存部分肿瘤组织用于检测ARHI mRNA。(5)观察ARHI再表达联合紫杉醇对细胞自噬和凋亡的影响,研究联合作用的机制。分别采用丫啶橙染色流式细胞仪定量分析细胞自噬率,Annexin V-PI标记流式细胞仪检测早期细胞凋亡。PI染色流式细胞仪检测DNA含量分析细胞周期分布。透射扫描电镜观察肿瘤中细胞自噬和凋亡。(6)所有实验数据均为连续计数资料,计数资料表示为均数±标准差(means±SD)。Bartlett’s test用于检验方差齐性,当p<0.1表示组间方差不齐。采用Student’s t test和Wilcoxon ranksum test比较组间差别。采用单因素方差分析或LSD检验法进行多组间比较。结果：(1)表观遗传修饰作用可以使乳腺癌细胞ARHI活化再表达,实时荧光定量RT-PCR检测ARHI/脂质体治疗组肿瘤组织内ARHI mRNA表达明显增高。pcDNA3-ARHI表达质粒导入细胞后ARHI蛋白呈高表达。(2)体外培养细胞和移植瘤细胞中ARHI活化再表达均可以诱导乳腺癌细胞自噬。(3)体外培养细胞和动物实验均表明ARHI再表达增强紫杉醇对乳腺癌生长的抑制作用。TSA联合紫杉醇对体外培养的乳腺癌细胞具有协同抑制作用。动物实验中,脂质体导入ARHI表达质粒治疗组和紫杉醇静脉注射治疗组对裸小鼠乳腺癌移植瘤的生长均具有抑制作用,联合治疗组的抑瘤率高于任何一个单药治疗组,说明ARHI基因导入肿瘤增强了紫杉醇对乳腺癌生长的抑制作用。(4)对联合作用机制的研究发现,ARHI在体内体外细胞中的再表达均明显诱导了乳腺癌细胞自噬,而无明显促凋亡作用。紫杉醇单独作用于细胞导致明显的凋亡,而不能有效诱导细胞自噬。两者单独作用于细胞时均有G2/M期阻滞作用。当两者联合作用时,凋亡率和自噬率均明显高于等剂量的任何一者单用组,并且增强对细胞G2/M期阻滞作用。透射扫描电子显微镜观察ARHI/脂质体治疗组可见到肿瘤细胞中自噬现象明显增多,而凋亡现象不多。紫杉醇单独治疗组观察到较多细胞凋亡现象,而较少自噬,ARHI/脂质体和紫杉醇联合治疗组中自噬和凋亡现象均明显增加。结论：ARHI在体内和体外乳腺癌中可以被活化再表达,并且通过诱导细胞自噬而抑制乳腺癌生长。ARHI再表达增强紫杉醇对乳腺癌生长的抑制作用,其作用机制是自噬和凋亡两条抑制肿瘤生长途径结合增强对乳腺癌细胞的抑制作用。从临床应用的角度考虑,促进ARHI再表达的方法联合紫杉醇化疗有希望用于乳腺癌的治疗,是值得深入研究的新方法。