肝纤维化是一切慢性肝病共同的病理学基础,当肝细胞发生坏死,或受到炎症刺激时,肝内纤维结缔组织会大量增生,这一病理过程中较轻而可逆者称为肝纤维化,重者出现假小叶及结节形成则称为肝硬化。其间涉及多种细胞的活化增殖或变性、多种细胞因子功能的表现、大量细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的分泌及细胞凋亡等复杂因素的病理生理过程。各种因素之间相互影响、相互交错,形成肝纤维化的动态变化网络。其中ECM成分合成和降解的失衡是导致肝组织重构、发生纤维化的直接原因,细胞因子及多肽类生长因子等调控因子是启动、调节肝纤维化发展的重要因素。肝损伤时瘦素水平的升高常导致纤维化的产生。瘦素和瘦素受体在肝纤维化形成中发挥重要的作用,血清瘦素是导致肝纤维化的始动因子之一,瘦素活化肝星状细胞以促进肝纤维化。正常肝组织不表达瘦素,但有其受体的mRNA存在。瘦素的免疫反应性仅存在于活化的肝星状细胞,在活化的肝星状细胞中,可见瘦素及其功能性受体的表达,瘦素的mRNA和蛋白的合成增加。在组织和血清中瘦素升高主要是活化的肝星状细胞大量表达瘦素。瘦素与肝星状细胞上的0b-R结合后,可通过调节肝星状细胞对细胞因子的表达,明显增加Ⅰ型胶原mRNA的表达,促进肝纤维化的进程。瘦素表达和肝纤维化的分期和进展有关,血清瘦素水平可在一定程度上反映肝纤维化的程度。加味升降散是在清·杨璇《伤寒温疫条辨》中升降散(僵蚕、蝉蜕、姜黄、大黄)的原方基础上加用三七、丹参、桃仁、蛇舌草组成,具有升清降浊、调补气血、活血化瘀、清热解毒、驱秽祛邪、疏肝解郁及补气健脾功效。目前对瘦素促肝纤维化的分子机制研究,国外处于刚起步阶段,国内相关文献报道更加少有。因此,我们认为系统的研究瘦素及其信号转导机制,并在此基础上探讨中药升降散对瘦素瘦素受体及受体后介导的信号转导通路的影响,有助于进一步阐明其抗肝纤维化的作用途径和作用靶点,为该中药防治和逆转肝纤维化提供更加充分的理论依据,同时,对于深化和完善肝纤维化的机制研究具有十分重要的理论意义。研究目的研究瘦素调控肝纤维化的信号转导机制及加味升降散的干预作用,以期揭示加味升降散抗纤维化的分子机制。研究方法1.加味升降散对肝纤维化大鼠肝功能及血清LN、Col-Ⅳ的影响72只SD大鼠在正式实验前适应性饲养3天,后随机分为5组,即正常对照组、模型组、秋水仙碱组、加味升降散大剂量组、中剂量组、小剂量组(简称中药高、中、低剂量组,剂量分别相当于20倍、10倍和5倍临床用药剂量),各组均12只。每只动物前3周注射部位为左右大腿外侧交替注射,后因为注射局部严重溃烂,不宜操作,故改为背部皮下注射。首次剂量为40%(体积分数)CCL4花生油5ml/kg;以后每3日注射3ml/kg。正常组注射等量花生油,进食普通饲料并自由饮水。其余各组均以普通饲料喂养,共8周。各组在造模第2天每日灌胃给相应药物,秋水仙碱组每日灌服秋水仙碱llmg/kg,加味升降散组高、中、低组分别每日5.5g/(kg.d)、11g/(kg.d)、22g/(kg.d)灌胃,正常组及模型组灌以等量蒸馏水作对照,共8周。采集标本后,采用放射免疫方法观察血清谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原蛋白(Col-Ⅳ)的水平。2.加味升降散对对肝纤维化大鼠肝组织病理形态学的影响采用苏木精-伊红染色(HE染色)、VG胶原染、色网状纤维染色(Gordon-Sweet法)观察肝组织病理形态学改变。3.加味升降散对肝纤维化大鼠肝组织瘦素及瘦素受体的影响检测大鼠肝组织瘦素及瘦素受体的表达,以及GF-β1在在大鼠肝组织中的表达。4.加味升降散对肝星状细胞TIMP-1mRNA表达的影响用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TIMP-1mRNA的表达,分别检测加味升降散干预6h、12h和24h对TIMP-1mRNA表达的影响情况。5.加味升降散对肝星状细胞内活性氧的影响本实验采用的活性氧检测试剂盒,通过荧光显微镜或流式细胞仪观察DCF的荧光强度来检测细胞内ROS的水平。分别检测各组药物作用1h后、12h后、24h后流式细胞仪检查的HSC-T6细胞内DCF荧光强度。6.加味升降散对HSC-T6细胞浆内p-JAK2及p-STAT3的蛋白表达的影响用免疫细胞化学方法测定HSC-T6细胞中p-JAK2及p-STAT3的活性,检测加味升降散对HSC-T6细胞浆内p-JAK2及p-STAT3蛋白表达的影响。研究结果1.加味升降散对肝纤维化大鼠肝功能及血清LN、Col-Ⅳ的影响加味升降散对肝纤维化大鼠ALT、AST值的影响：模型组ALT、AST值明显升高,与正常组相比(P<0.001),治疗各组ALT均显著低于模型组(P<0.01),但高于正常组,AST低于模型组(P<0.01),与正常组相比,无显著差异(P>0.05),中药大剂量组ALT、 AST值明显降低、优于秋水仙碱组、中剂量组及低剂量组(P<0.05)。秋水仙碱组、中药中剂量组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)；秋水仙碱组与中药低剂量组比较,血清AST、ALT水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。加味升降散对肝纤维化大鼠血清LN、Col-Ⅳ的影响：与正常组数值相比,模型组、秋水仙碱组、中药低、中剂量组大鼠血清LN、Col-Ⅳ含量可见明显的升高(P<0.05),中药高剂量组数值与正常组差异无统计学意义；与模型组相比,中药各剂量组、对照药组血清LN、Col-Ⅳ明显的降低(P<0.05)；与对照药组相比,中药高剂量组血清LN、Col-Ⅳ含量明显减低(P<0.05),中药低剂量组血清LN、Col-Ⅳ含量较高(P<0.05),中药中剂量组与之差异无统计学意义；中药各剂量组之间的比较,中药低剂量组血清LN、Col-Ⅳ含量高,中药高剂量组含量最低,中药中剂量组居中,中药各剂量组间存在显著性差异(P<0.05)。结果提示,加味升降散可明显降低肝纤维化大鼠血清ALT、AST、LN、Col-IV水平,有助于肝纤维化的治疗。2.加味升降散对对肝纤维化大鼠肝组织病理形态学的影响实验结果表明：正常组肝小叶结构清楚,肝细胞围绕中央静脉呈索状排列,无变性坏死,未见肝纤维组织增生及炎性细胞浸润。模型组肝小叶结构破损,肝细胞索排列紊乱,肝细胞变性,部分肝细胞坏死,伴有中性粒细胞及淋巴细胞浸润,纤维组织大量增生,个别动物见假小叶形成。秋水仙碱组与中药治疗各剂量组肝脏损伤程度均较模型组轻,肝小叶结构破坏减轻,肝脏胶原纤维增生减轻,肝细胞水肿好转,变性情况明显改善,炎细胞浸润减少。加味升降散高剂量组肝脏结构改善最为明显。3.加味升降散对肝纤维化大鼠肝组织瘦素及瘦素受体的影响实验结果表明：模型组肝组织中Leptin、OB-Rb的表达均较正常组显著增多,阳性细胞数的增多与肝内炎症细胞、纤维多少呈正相关,证实Leptin、OB-Rb在肝纤维化过程中起重要作用。在CC14注射1、4、8周组肝组织中,TGF-β1的表达明显增多、增强,可见小叶中央静脉周围、汇管区以及肝窦Disse腔间隙内均有大量斑片状、条索状弥漫分布的TGF-β1阳性表达。实验证明加味升降散能有效地抑制促肝纤维化细胞因子Leptin及其信号通路,阻止其进一步活化所发挥的病理作用。4.加味升降散含药血清对肝星状细胞TIMP-1mRNA表达的影响实验结果表明：瘦素刺激HSC后,TIMP-1mRNA较正常组表达水平明显增高,与以往报道的研究结果一致。在给予JAK抑制剂AG490能抑制TIMP-1mRNA表达,说明瘦素通过JAK-STST信号转导通路对TIMP-1mRNA进行调控的。而抗氧化剂NAC和NOX抑制剂DPI也能抑制TIMP-1mRNA表达,结合前期研究,瘦素主要通过诱导NOX产生ROS,因此推测ROS介导了瘦素在HSC-T6细胞内的信号转导,从而影响了TIMP-1mRNA的表达。5.加味升降散含药血清对肝星状细胞内活性氧的影响HSC-T6细胞经瘦素刺激1h后其内DCF荧光强度增高,较空白对照组明显升高(P<0.001),表明瘦素能够诱导HSC-T6细胞内ROS的产生；随着瘦素作用时间延长,瘦素作用HSC-T6细胞24h时细胞内DCF荧光强度要高于作用12h时(P<0.05)；加味升降散处理组、NAC处理组细胞内DCF荧光强度均低于同时间点瘦素刺激组(P<0.01),在12、24h加味升降散处理组均低于NAC处理组(P<0.01)；随着作用时间延长,加味升降散处理组1、12、24小时细胞内DCF荧光强度逐渐降低,其差异有统计学意义(P<0.01)。6.加味升降散含药血清对HSC-T6细胞浆内p-JAK2及p-STAT3蛋白表达的影响本实验首次发现,在瘦素作用HSC-T6细胞前给予加味升降散含药血清处理后,p-JAK2、p-STAT3的表达下降,表明加味升降散能够抑制JAK2、STAT3信号转导通路的激活。加味升降散抑制STAT3磷酸化蛋白的表达后,有效的阻止了磷酸化的STAT3形成二聚体移位到细胞核内,从而影响了基因的转录,如抑制TIMP-1mRNA表达,上调MMP-1mRNA表达。结论：综上所述,加味升降散具有综合抗肝纤维化的药理作用,其作用机制为多途径、多靶点。抑制Leptin的表达、抑制OB-Rb及其JAK2/STAT3信号转导通路,可能是其抗肝纤维化的分子机制之一。而这一机制与抑制炎症反应,调节血脂水平,保护肝细胞功能,减少细胞因子所产生的瀑布级联效应,从而抑制肝纤维化的启动密切相关。