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第一章UC-MSCs分化为角膜上皮细胞的实验研究目的：探讨在体外条件下诱导UC-MSCs(脐带间充质干细胞)分化为角膜上皮细胞的可行性。方法：消化法分离培养UC-MSCs细胞,流式细胞技术检测细胞表型、细胞周期,MTT检测细胞生长增殖能力。将UC-MSCs在不同浓度的EGF (5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml)下培养,观察EGF能否诱导UC-MSCs分化为角膜上皮细胞。确定细胞分化的最佳时间。同时,将UC-MSCs与兔角膜上皮细胞共培养,观察分化情况,免疫组化检测角膜上皮相关蛋白的表达。结果：采用消化法可以在体外条件下成功地分离培养UC-MSCs,其表达CD29、CD34,细胞保持着较旺盛的增殖能力。在15ng/ml EGF处理30天的条件下,UC-MSCs可以部分表达角膜上皮细胞的标记K3；UC-MSCs在与角膜上皮细胞共培养2周后,UC-MSCs细胞可以检测到K3、ABCG2与P63的部分表达。结论：体外条件下,采用共培养的方法可以诱导UC-MSCs分化为角膜上皮细胞。第二章利用核酸酶联合低温电泳制备脱细胞猪角膜基质目的：探索使用核酸酶联合低温电泳制备的脱细胞猪角膜基质(Decellularized porcine corneal matrix, DPCM)作为生物角膜支架材料的可行性。方法：去除猪角膜上皮与内皮细胞之后,使用17U/mL DNase Ⅰ处理正常猪角膜(Native porcine cornea,MPC),利用低温电泳清除残留的细胞与DNA碎片,制备DPCM,并对制备的DPCM进行相关的生物学与物理学特性的评价。主要有：检测DPCM的大体形态、组织学特点、去细胞效率、DNA含量、蛋白多糖、超微结构的改变；检测DPCM的透光率、生物相容性；DPCM浸提液对角膜上皮细胞、基质细胞、内皮细胞增殖活性的影响。结果：通过核酸酶联合低温电泳的脱细胞方法可以成功去除NPC中96.43%的DNA成分,保留了92%的氨基葡聚糖成分；而且DPCM中胶原纤维的超微结构没有发生明显的变化；在300-800nnm波长范围内,DPCM的透光率与NPC没有显著差异；DPCM保持了良好的生物力学特点；皮下移植试验没有观察到炎症细胞浸润的现象；DPCM浸提液对角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞的增殖活性没有影响。结论：使用核酸酶联合低温电泳的脱细胞方法有效地清除了细胞成分,良好地保存了角膜基质的精密超微结构,保留了胶原纤维的有序排列,储备了92%的蛋白多糖成分。该方法脱细胞效率明显,特异性强；DPCM具有高度的透明性、极低的免疫原性、良好的生物相容性、足够的生物力学强度和长期的生物稳定性。第三章组织工程板层角膜的构建与体内移植目的：利用DPCM为载体,为UC-MSCs提供生长的微环境,构建组织工程化板层角膜(Tissue engineering lamellar cornea,TELC),并评价其整体功能。方法：将UC-MSCs接种在DPCM上,体外培养1、2、3周后,在各时间点取材对构建的TELC进行HE染色观察其组织结构特点,透射电镜检测细胞连接形成的情况；免疫荧光检测K3、ZO-1、Cadherin、integrinp4、LN、FN等蛋白的表达情况；通过新西兰大白兔的体内板层角膜移植(lamellar keratoplasty, LKP)实验,评价TELC的整体功能：植片上皮化时间、透明性、透光率、生物学相容性、术后愈合情况等。结果：UC-MSCs可以在DPCM上生长,并被诱导分化为角膜上皮细胞。在体外构建过程中,12天可以形成具备3-4层上皮细胞的TELC。该材料上的细胞已经具备明显的黏附、增殖和形成复层上皮的能力。体内移植后,DPCM组上皮化的时间大约为7+2天,完全透明的时间为30±5天。与DPCM组相比,TELC组术后第一天就达到了完全上皮化,荧光素钠染色阴性,植片透明。在300-800nm波长范围内,TELC组比DPCM组的透光率略有增强。结论：利用UC-MSCs作为种子细胞,DPCM作为支架材料,可以成功构建具备生理功能的生物材料TELC;构建的TELC在体内条件下可以保持良好的生物相容性、良好的透明性与屏障功能。