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目的:通过转染丙型肝炎病毒非结构蛋白4B至LO2肝细胞中,研究HCV-NS4B对肝细胞生长曲线、细胞周期以及PCNA、cyclinD1的表达的影响,探讨HCV-NS4B对肝细胞增殖的影响及其可能机制。
方法:首先将LO2肝细胞培养于含10%小牛血清RPMI 1640,37℃、5%CO2孵箱中,每2~3天换液一次。实验分为三组:空白对照组、空白载体:PCXN2组、PCXN2-NS4B组。取对数生长期细胞,以0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞按1~3×105/ml接种于6孔板中,置于37℃、5%CO2孵箱中培养至细胞生长达60~80%汇合时开始转染。转染前以无血清培养基洗细胞两次,以1.5 ug/4 ug分别配制质粒/月旨质体混合物,轻柔混合后室温下静置15分钟,将混合物逐滴加入相应各孔,6小时后以完全培养基更换转染培养基,继续培养;24小时后加入G418(800ug/ml)筛选。待空白对照组细胞全部死亡后,6418减量为200ug/ml,维持筛选并传代培养。RT-PCR对转染细胞提取总RNA进行逆转录扩增,产物于1%琼脂糖电泳鉴定。鉴定质粒成功转染入肝细胞后进行如下实验:
1.MTT法绘制转染空白载体PCXN2组及质粒PCXN2-NS4B组细胞生长曲线。将上述转染成功的空白载体PCXN2组及质粒PCXN2-NS4B组细胞以0.25%胰蛋白酶消化,按1×103/孔接种于96孔板,各接种5个复孔,共接种7个板,以完全培养基作为空白调零孔,置于37℃,5%CO2孵箱中培养。每日取一个96孔板检测,测OD值,以时间为横坐标,OD值为纵坐标,绘制生长曲线。观察空白载体PCXN2组及转染质粒PCXN2-NS4B组细胞生长情况。
2.流式细胞仪检测PCXN2组及PCXN2-NS4B组的细胞周期。将转染PCXN2组及PCXN2-NS4B两组的肝细胞以0.25%胰蛋白酶消化,每组细胞各取1~2×106转移到离心管,离心,弃上清液,细胞沉淀用1 mlPBS冲洗2次,再用PBS制成细胞悬液,加入PI染色剂染色(避光),流式细胞仪检测PCXN2组及PCXN2-NS4B组的细胞周期的情况。
3.免疫组化方法观察PCXN2组及PCXN2-NS4B组中cyclinD1、PCNA的表达情况。将上述转染成功的PCXN2组及PCXN2-NS4B组细胞以0.25%胰蛋白酶充分消化,显微镜下计数,以1×105传代于预置玻片(经多聚赖氨酸包被)的6孔板中,置于37℃、5%CO2孵箱中培养。分别加入丙酮固定30分钟,依次加入0.3%Triton X-100通透细胞,30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟去内源性过氧化物酶,吸尽液体,蒸馏水洗2次。严格按照SABC试剂盒滴加5%BSA封闭液,cyclinD1、PCNA-抗,对照组以PBS代替-抗作阴性对照,4℃冰箱过夜,滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,然后滴加SABC复合物孵育20分钟,临用时配制DAB显色液显色,苏木素复染,盐酸乙醇分化,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察,照相。
结果:
1.用G418对各实验组的细胞进行筛选,结果显示:G418 800ug/ml筛选24小时后,各组均有少许细胞脱壁漂浮;72小时后各组均有较多细胞脱壁漂浮,给予换液,继续培养;96小时后各组均有大量细胞脱壁漂浮,转染PCXN2及PCXN2-NS4B组贴壁细胞明显多于空白对照组,给予换液,继续培养;第8天转染PCXN2及PCXN2-NS4B组形成新生细胞克隆,呈集落状,第14天对照组细胞全部死亡,G418减量为200 ug/ml维持筛选,继续传代培养。
2.提取转染组PCXN2-NS4B细胞总RNA,RT-PCR扩增,RT-PCR产物于1%琼脂糖电泳可见PCXN2-NS4B有mRNA表达,表明PCXN2-NS4B已转染入LO2细胞,并有稳定表达。
3.利用MTT法绘制PCXN2组及PCXN2-NS4B组的两条曲线显示:PCXN2组不如PCXN2-NS4B组生长状况好;两组细胞生长第1、2天曲线的斜率无明显变化,之后细胞生长进入对数期,在PCXN2组及PCXN2-NS4B组都表现出了对数期的大量增殖,曲线的斜率增加,但PCXN2组对数期曲线的斜率不如PCXN2-NS4B组明显。数据用重复测量的方差分析显示:不同测量时间细胞的OD值有差异(P<0.01);对比进行的趋势分析提示细胞的OD值随时间的变化具有线型特征(P<0.01);可以认为分组与时间因素之间存在交互作用(P<0.01);可以认为PCXN2组及PCXN2-NS4B组间OD值总体均数不同(P<0.01)。即转染PCXN2-NS4B组与PCXN2组比较,细胞生长速度增加。差异有统计学意义(P<0.01)。
4.流式细胞术观察PCXN2组及PCXN2-NS4B组的细胞周期显示:PCXN2组G0/G1期、S期、G2/M期分别为(65.28±6.23)%、(27.39±4.89)%、(7.34±4.54)%;转染PCXN2-NS4B组G0/G1期、S期、G2/M期分别(46.89±5.60)%、(36.31±4.36)%、(16.80±6.79)%。两组G0/G1期、S期、G2/M期之间比较,差异有显著性(P<0.05)。
5.免疫组化:以细胞核内棕黄色着色为阳性结果,不着色为阴性,细胞计数以低倍视野100个细胞,共5个视野的阳性细胞,取其均值为阳性细胞数作统计处理。转染PCXN2组及PCXN2-NS4B组均有cyclinD1表达,PCXN2组表达率为(9.75±3.05)%,PCXN2-NS4B组表达率为(14.72±4.90)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。
6.转染空白载体PCXN2组、PC2XN2-NS4B组在胞核均有PCNA表达,PCXN2组表达率为(24.63±6.29)%,PCXN2-NS4B组表达率为(36.29±4.62)%,两组比较差异有显著性(P<0.01)。
结论:
1.NS4B转染入肝细胞后有稳定表达;
2.NS4B对细胞的增殖有一定促进作用;
3.NS4B可干扰肝细胞周期;
4.NS4B可促进cyclinD 1、PCNA表达;
5.NS4B通过增进细胞周期素cyclinD1、PCNA表达,干扰肝细胞周期,出现S期阻滞,DNA合成增加,促进肝细胞增殖,在丙型肝炎致癌机制中可能起一定作用。