目的：通过转染丙型肝炎病毒非结构蛋白4B至LO2肝细胞中，研究HCV-NS4B对肝细胞生长曲线、细胞周期以及PCNA、cyclinD1的表达的影响，探讨HCV-NS4B对肝细胞增殖的影响及其可能机制。 方法：首先将LO2肝细胞培养于含10％小牛血清RPMI 1640，37℃、5％CO2孵箱中，每2～3天换液一次。实验分为三组：空白对照组、空白载体：PCXN2组、PCXN2-NS4B组。取对数生长期细胞，以0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞按1～3×105/ml接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2孵箱中培养至细胞生长达60～80％汇合时开始转染。转染前以无血清培养基洗细胞两次，以1.5 ug/4 ug分别配制质粒/月旨质体混合物，轻柔混合后室温下静置15分钟，将混合物逐滴加入相应各孔，6小时后以完全培养基更换转染培养基，继续培养；24小时后加入G418(800ug/ml)筛选。待空白对照组细胞全部死亡后，6418减量为200ug/ml，维持筛选并传代培养。RT-PCR对转染细胞提取总RNA进行逆转录扩增，产物于1％琼脂糖电泳鉴定。鉴定质粒成功转染入肝细胞后进行如下实验： 1.MTT法绘制转染空白载体PCXN2组及质粒PCXN2-NS4B组细胞生长曲线。将上述转染成功的空白载体PCXN2组及质粒PCXN2-NS4B组细胞以0.25％胰蛋白酶消化，按1×103/孔接种于96孔板，各接种5个复孔，共接种7个板，以完全培养基作为空白调零孔，置于37℃，5％CO2孵箱中培养。每日取一个96孔板检测，测OD值，以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制生长曲线。观察空白载体PCXN2组及转染质粒PCXN2-NS4B组细胞生长情况。 2．流式细胞仪检测PCXN2组及PCXN2-NS4B组的细胞周期。将转染PCXN2组及PCXN2-NS4B两组的肝细胞以0.25％胰蛋白酶消化，每组细胞各取1～2×106转移到离心管，离心，弃上清液，细胞沉淀用1 mlPBS冲洗2次，再用PBS制成细胞悬液，加入PI染色剂染色(避光)，流式细胞仪检测PCXN2组及PCXN2-NS4B组的细胞周期的情况。 3．免疫组化方法观察PCXN2组及PCXN2-NS4B组中cyclinD1、PCNA的表达情况。将上述转染成功的PCXN2组及PCXN2-NS4B组细胞以0.25％胰蛋白酶充分消化，显微镜下计数，以1×105传代于预置玻片(经多聚赖氨酸包被)的6孔板中，置于37℃、5％CO2孵箱中培养。分别加入丙酮固定30分钟，依次加入0.3％Triton X-100通透细胞，30％H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟去内源性过氧化物酶，吸尽液体，蒸馏水洗2次。严格按照SABC试剂盒滴加5％BSA封闭液，cyclinD1、PCNA-抗，对照组以PBS代替-抗作阴性对照，4℃冰箱过夜，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，然后滴加SABC复合物孵育20分钟，临用时配制DAB显色液显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，照相。 结果： 1．用G418对各实验组的细胞进行筛选，结果显示：G418 800ug/ml筛选24小时后，各组均有少许细胞脱壁漂浮；72小时后各组均有较多细胞脱壁漂浮，给予换液，继续培养；96小时后各组均有大量细胞脱壁漂浮，转染PCXN2及PCXN2-NS4B组贴壁细胞明显多于空白对照组，给予换液，继续培养；第8天转染PCXN2及PCXN2-NS4B组形成新生细胞克隆，呈集落状，第14天对照组细胞全部死亡，G418减量为200 ug/ml维持筛选，继续传代培养。 2．提取转染组PCXN2-NS4B细胞总RNA，RT-PCR扩增，RT-PCR产物于1％琼脂糖电泳可见PCXN2-NS4B有mRNA表达，表明PCXN2-NS4B已转染入LO2细胞，并有稳定表达。 3．利用MTT法绘制PCXN2组及PCXN2-NS4B组的两条曲线显示：PCXN2组不如PCXN2-NS4B组生长状况好；两组细胞生长第1、2天曲线的斜率无明显变化，之后细胞生长进入对数期，在PCXN2组及PCXN2-NS4B组都表现出了对数期的大量增殖，曲线的斜率增加，但PCXN2组对数期曲线的斜率不如PCXN2-NS4B组明显。数据用重复测量的方差分析显示：不同测量时间细胞的OD值有差异(P＜0.01)；对比进行的趋势分析提示细胞的OD值随时间的变化具有线型特征(P＜0.01)；可以认为分组与时间因素之间存在交互作用(P＜0.01)；可以认为PCXN2组及PCXN2-NS4B组间OD值总体均数不同(P＜0.01)。即转染PCXN2-NS4B组与PCXN2组比较，细胞生长速度增加。差异有统计学意义(P＜0.01)。 4．流式细胞术观察PCXN2组及PCXN2-NS4B组的细胞周期显示：PCXN2组G0/G1期、S期、G2/M期分别为(65.28±6.23)％、(27.39±4.89)％、(7.34±4.54)％；转染PCXN2-NS4B组G0/G1期、S期、G2/M期分别(46.89±5.60)％、(36.31±4.36)％、(16.80±6.79)％。两组G0/G1期、S期、G2/M期之间比较，差异有显著性(P＜0.05)。 5．免疫组化：以细胞核内棕黄色着色为阳性结果，不着色为阴性，细胞计数以低倍视野100个细胞，共5个视野的阳性细胞，取其均值为阳性细胞数作统计处理。转染PCXN2组及PCXN2-NS4B组均有cyclinD1表达，PCXN2组表达率为(9.75±3.05)％，PCXN2-NS4B组表达率为(14.72±4.90)％，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。 6．转染空白载体PCXN2组、PC2XN2-NS4B组在胞核均有PCNA表达，PCXN2组表达率为(24.63±6.29)％，PCXN2-NS4B组表达率为(36.29±4.62)％，两组比较差异有显著性(P<0.01)。 结论： 1．NS4B转染入肝细胞后有稳定表达； 2．NS4B对细胞的增殖有一定促进作用； 3．NS4B可干扰肝细胞周期； 4．NS4B可促进cyclinD 1、PCNA表达； 5．NS4B通过增进细胞周期素cyclinD1、PCNA表达，干扰肝细胞周期，出现S期阻滞，DNA合成增加，促进肝细胞增殖，在丙型肝炎致癌机制中可能起一定作用。