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研究目的1.通过观察TA2小鼠不同次数妊娠期间及分娩后不同时间脾细胞中T淋巴细胞亚群以及IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ四种细胞因子的变化规律,揭示妊娠及分娩与TA2小鼠T细胞免疫功能的关系。通过比较经产、未产及自发瘤组TA2小鼠机体T细胞免疫状况,初步探讨T细胞免疫功能与TA2小鼠自发性乳腺癌的发生机制。2.通过将TA2小鼠不同次数妊娠期间及分娩后不同时间T细胞免疫状况与其机体雌二醇(E2)、孕酮(P)分泌水平进行相关性分析,初步揭示E2、P与T细胞免疫功能的关系,并采用外源性注射雌激素与孕激素的实验验证其间关系。3.通过观察TA2小鼠不同次数妊娠期间及分娩后不同时间乳腺上皮细胞增殖指数以及凋亡指数的变化,初步推断TA2小鼠发瘤前乳腺上皮细胞的状态；同时,通过检测线粒体凋亡通路中,Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达,以及乳腺上皮细胞中雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的表达,对比发瘤前及发瘤后的状态,探讨TA2小鼠自发性乳腺癌发生的可能机制。研究方法1.收集TA2小鼠不同次数妊娠期间及分娩后不同时间以及自发瘤小鼠脾细胞和血清,采用流式细胞术检测脾细胞CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群,计算CD4+/CD8+T细胞比值。利用ELISA方法检测血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ四种细胞因子水平,并计算Th1/Th2。2.采用相关性分析,分析E2、P与CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群以及IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ四种细胞因子之间的相关性。3.对成年TA2雌鼠行卵巢切除术(OVX),外源性给与雌激素、孕激素干预,观察E2和/或P对OVX小鼠T细胞免疫功能的影响。4.收集TA2小鼠不同次数妊娠期间及分娩后不同时间以及自发瘤小鼠乳腺组织,采用免疫组化方法检测乳腺上皮细胞中PCNA的表达,计算增殖指数；采用TUNEL方法检测乳腺上皮细胞中的细胞凋亡,计算凋亡指数；采用免疫组化、Real-time PCR和Western blotting方法检测组织中ER、PR、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达及mRNA相对表达水平。结果1.妊娠及分娩对TA2小鼠T细胞免疫功能的影响(1)对T淋巴细胞亚群的影响：TA2小鼠妊娠及分娩后不同时间内CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+差别具有统计学意义(P<0.01)。其中CD3+、CD4+T淋巴细胞在P10下降至最低(12.79±3.64,58.36±6.57,P<0.01),在P20,CD4+/CD8+降至最低(1.81±0.14),CD8+T升至最高(32.68±2.93)。分娩后,CD4+、CD8+和CD4+/CD8+逐渐恢复,但CD3+T仍有下降趋势,在分娩后42天时才恢复正常。多次妊娠不同时段与8月龄处女鼠(8MV)和自发乳腺癌(SBC)小鼠比较,CD3+、CD4+T在各次妊娠P10、P20均显著低于8MV(P<0.05),且P10CD3+T与SBC无差别(P>0.05),P10、P20 CD4+T均接近SBC (P>0.05),CD4+T在3PP42、4PP42时亦与SBC无差别(P>0.05)。CD4+/CD8+在1P20、2P10和3P、4P各时段均低于8MV (P<0.01)。CD3+、CD4+、CD8+T和CD4+/CD8+在4P各时段均低于或高于8MV(P<0.01),而与SBC无差别(P>0.05)。4次妊娠中,4P CD3+、CD4+和CD4+/CD8+明显低于1P、2P(P<0.05)。(2)对细胞因子的影响：TA2小鼠妊娠及分娩后不同时间内IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和Th1/Th2差别具有统计学意义(P<0.05)。IL-2、IL-4、IFN-γ和Th1/Th2在妊娠期间有所下降,IL-10有所上升,以10天和20天显著(P<0.05)。分娩后,IL-4、IL-10和Th1/Th2逐渐恢复,IL-2于分娩后1天恢复至正常未妊娠水平,但随后又逐渐下降,在分娩后42天时才恢复正常,IFN-γ在分娩后仍有下降,在分娩后42天虽有所恢复但未达正常。IL-2和IFN-γ在2P10、3P10、3P20、4P各时段均显著低于8MV(P<0.05),IL-4仅在4P10和4P20低于8MV(P<0.05),IL-10在1P10、1P20、2P20显著高于8MV, Th1/Th2在各妊娠次数P10以及4P各个时段均低于8MV (P<0.05)。4P各时段几乎均与SBC无差别(P>0.05),且4P各时段指标均不同程度低于1P～3P。2.雌激素与孕激素对TA2小鼠T细胞免疫功能的影响(1)妊娠及分娩对TA2小鼠E2和P的影响：TA2小鼠妊娠及分娩后不同时间内E2和P差别均具有统计学意义(P<0.01)。随着妊娠天数的增加,血清E2和P的浓度逐渐升高,以P20最为明显(E2：184.48±72.94,P：78.32±34.17,P<0.01)。分娩后,E2逐渐下降恢复正常,P立即下降后又有所波动,最后于PP21恢复正常(P>0.05)。多次妊娠间,以4P20血清E2和P浓度最高,且明显高于1P、2P(P<0.01)。(2)相关性分析结果显示：E2、P与CD8+T和IL-10呈正相关(P<0.01),而E2与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IL-2、IL-4、IFN-γ呈负相关(P<0.05)；P与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IL-2呈负相关(P<0.01)。P与IL-4、IFN-γ之间相关关系不明显(P>0.05)。(3)外源性给与雌激素、孕激素干预结果显示：与对照组比较,E2+P联合作用组各指标均与对照有差别,且具有统计学意义(P<0.01)；E2单独作用组CD3+T淋巴细胞、CD4+/CD8+和IL-2、IL-4均明显低于对照(P<0.05或P<O.01)；P单独作用组仅CD3+T淋巴细胞和IL-2明显低于对照(P<0.05),其它均与对照无差别。其中,E2+P作用最为明显,且高浓度作用大于低浓度作用。3.妊娠及分娩对TA2小鼠乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响TA2小鼠妊娠及分娩后不同时间内增殖指数(PI)和凋亡指数(AI)差别均具有统计学意义(P<0.01)。随着妊娠天数的增加,AI逐渐增加,以P20最为明显(47.23±15.89,P<0.01)。分娩后,AI并未立即下降,在PP1和PP7仍然持续较高水平,PP21以后逐渐下降。AI在妊娠期间较低,分娩后有所升高,以PP1最高(59.48±11.37,P<0.01),随后有所下降。多次妊娠间,以4P20 PI和AI最高(86.20±7.09,74.80±10.99),且明显高于1P、2P(P<0.01)。4.ERα和PR在TA2小鼠乳腺上皮细胞中的表达(1)免疫组化染色结果显示：妊娠和分娩不同阶段乳腺上皮细胞ERα和PR表达差异具有统计学意义(P<0.01)。妊娠后乳腺上皮细胞中ERα和PR表达明显高于未妊娠小鼠,到妊娠20天达到最大(ERa:84.60±9.40, PR:2.52±0.81, P<0.01)。分娩后表达水平逐渐下降,到第42天,基本与未妊娠小鼠相近。多次妊娠间,4P小鼠各时段ERα和PR表达明显高于1P、2P(P<0.01或P<0.05)。(2) Real-time PCR结果显示：不同妊娠次数TA2小鼠ERαmRNA和PR mRNA表达之间差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),且4P小鼠各时段ERαmRNA和PR mRNA表达均不同程度明显高于1P～3P(P<0.01或P<0.05)。5. Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9在不同妊娠次数TA2小鼠乳腺上皮细胞中的表达(1)免疫组化染色结果显示：正常TA2小鼠乳腺上皮细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9均呈低表达。妊娠期时均有所升高,其中以妊娠20天时最为明显(P<0.01或P<0.05)；在分娩后,Bcl-2、Bax、Caspase-3继续升高,到了分娩后21天,达到最大值(Bcl-2:8.04±0.83; Bax:9.92±0.77; Caspase-3: 9.60±0.40, P=0.000), Caspase-9变化不大。到分娩后42天基本恢复至正常。不同妊娠次数TA2小鼠Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9表达之间差异具有统计学意义(P<0.01)。4P小鼠各时段Bcl-2和Bax表达明显高于1P～3P (P<0.01), Caspase-3和Caspase-9表达明显高于1P、2P(P<0.01或P<0.05)。(2)Real-time PCR结果显示：不同妊娠次数TA2小鼠四个基因表达差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。其中,4P小鼠各时段bcl-2, bax, caspase-3和caspase-9 mRNA表达明显高于1P～3P(P<0.01或P<0.05)。(3) Western blotting结果显示：基本与免疫组化结果一致。3P、4P小鼠各时段Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9表达明显高于1P、2P(P<0.01或P<0.05),其中以妊娠20天最为显著。6. ER、PR、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9在正常乳腺、癌前乳腺及乳腺癌组织中的表达免疫组化染色,Real-time PCR以及Western blotting结果一致显示：与8MV比较,除PR低于8MV(P<0.01)外,SBC小鼠乳腺ERa, Bcl-2, Bax, Caspase-3和Caspase-9表达均明显高于8MV(P<0.01或P<0.05)；自发瘤组织中ERα, PR, Bcl-2, Bax, Caspase-3和Caspase-9蛋白表达均明显低于8MV(P<0.01),但bcl-2,,bax和caspase-3 mRNA表达均显著高于正常8MV小鼠(P<0.01), caspase-9 mRNA略高于8MV,但无统计学意义(P>0.05)。ERα和PR mRNA在肿瘤组织中表达均低于正常8MV小鼠(P<0.01),其中PR更为明显(P<0.01)。结论多次妊娠及分娩使TA2小鼠体内雌激素与孕激素持续处于高水平,如此,一方面使TA2小鼠机体长期处于细胞免疫被抑制的状态,而造成体液免疫机制被慢性激活；另一方面刺激乳腺上皮细胞增殖,并通过线粒体途径的特殊机制调节乳腺上皮细胞凋亡。雌激素与孕激素分别经其各自受体,破坏TA2小鼠Th1/Th2的平衡以及乳腺上皮细胞增殖和凋亡的平衡,以致TA2小鼠自发乳腺癌成为可能。