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慢性髓细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）的致病根源是bcr-abl融合基因形成并编码异常的酪氨酸激酶活性的BCR-ABL癌蛋白。BCR-ABL癌蛋白可以激活下游一系列信号通路,引起细胞异常增殖,凋亡受阻。目前,酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKIs）被广泛用于慢性髓细胞白血病的治疗,并取得了良好的治疗效果。但是,慢性髓细胞白血病患者对TKIs耐药或不耐受的出现限制了TKIs进一步的应用。此外,TKIs通过抑制BCR-ABL癌蛋白的酪氨酸激酶活性发挥作用,而并不能清除BCR-ABL癌蛋白这一致病根源。因此,我们提出将抗BCR-ABL抗体运送至CML内,特异性结合BCR-ABL癌蛋白,并通过Trim-Away途径降解BCR-ABL癌蛋白,从而发挥抗肿瘤效应的研究思路。为了利用治疗性抗体开发治疗慢性髓细胞白血病的替代策略,并解决抗体不能穿过细胞膜的问题,在设计中我们利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly（d,l-lactide-co-glycolide）,PLGA）合成纳米颗粒,并运载抗BCR-ABL抗体进入CML细胞内发挥抗肿瘤效应。因CML细胞膜表面高表达转铁蛋白受体（Transferrin Receptor,Tf R）,我们在PLGA纳米颗粒表面修饰转铁蛋白（Transferrin,Tf）用于进一步提高纳米颗粒对CML细胞的靶向性。并在CML细胞株和CML小鼠模型中验证这种纳米颗粒（Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs）的抗肿瘤效应和作用机制,探究其临床应用的可行性,旨在为CML,特别是对TKIs耐药的CML患者提供新的治疗方法。采取的主要研究方法如下:1.纳米颗粒的合成及表征。采用溶剂挥发法合成包载抗BCR-ABL抗体的PLGA纳米颗粒,并在纳米颗粒表面标记转铁蛋白,称作Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs。随后利用动态光散射（Dynamic light scattering,DLS）和透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）对纳米颗粒进行表征。通过模拟细胞内环境检测纳米颗粒的释放率。利用SDS-PAGE实验和dot blotting实验验证纳米颗粒的成分和转铁蛋白修饰情况。通过溶血试验及蛋白吸附实验检测纳米颗粒的溶血情况和蛋白吸附情况,以探究纳米颗粒的血液相容性和稳定性。利用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）和荧光显微镜检测纳米颗粒的细胞的摄取情况。通过共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM）检测纳米颗粒的细胞内定位情况。2.Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs对CML细胞增殖凋亡的影响。将Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs与CML细胞共孵育后,通过western blot实验检测CML细胞内BCR-ABL,p-BCR-ABL及其下游信号分子的表达量的影响;通过CCK-8实验及克隆形成实验检测Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs对CML细胞增殖能力及克隆形成能力的影响;利用流式细胞术及DAPI染色检测Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs对CML细胞凋亡的影响;通过western blot实验检测CML细胞内凋亡相关分子PARP及caspase-3的活化情况。为了检测Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs对BCR-ABL阴性细胞株的毒性,我们在HL-60、NB4、A569中验证了Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs对其增殖和凋亡的影响。3.Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs通过Trim-Away途径发挥效应。我们对TRIM21及蛋白酶体在Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs引起的BCR-ABL蛋白降解中的作用进行探究。使用蛋白酶体抑制剂MG132处理CML细胞或使用si RNA将Trim21敲低,通过western blot检测Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs对BCR-ABL蛋白的降解效果。通过荧光共定位分析及Co-IP实验检测经Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs处理后,CML细胞内BCR-ABL癌蛋白与TRIM21的互作情况。4.Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs对CML细胞致小鼠白血病能力的影响。通过免疫缺陷小鼠NOD-SCID（Non-obese diabetes-scid）小鼠构建CML小鼠血液瘤模型。在使用K562/G01细胞造瘤一周后,通过尾静脉向小鼠注射Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs、Tf-Cou6-PLGA NPs、PLGA NPs或PBS。每周检测小鼠体重和外周血白细胞数量。待小鼠出现精神萎靡,弓背跛行等症状时,处死小鼠,对小鼠肝脾重量进行称量,检测小鼠骨髓中CD45阳性细胞比例,监测小鼠生存期。分析小鼠外周血中AST、ALT及BUN含量,以判断纳米颗粒对小鼠肝脏和肾脏功能的影响。通过HE染色,分析小鼠主要脏器中的炎性细胞浸润情况,以评估纳米颗粒的生物安全性。将添加了转铁蛋白修饰的Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs或无转铁蛋白修饰的Ab@Cou6-PLGA NPs通过尾静脉注射到小鼠体内,24 h后剖出小鼠主要脏器,含心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及小鼠骨头,并通过小动物成像仪检测纳米颗粒在各组织中的富集情况,以反映纳米颗粒的体内分布情况及靶向情况。取得的主要实验结果及结论如下:1.构建了包载抗BCR-ABL抗体的PLGA纳米颗粒,并成功在纳米颗粒表面添加了转铁蛋白修饰。体外释放结果显示,纳米颗粒在p H为5.0的酸性条件下比在中性条件下有更高的释放率,为纳米颗粒的细胞内释放创造了先决条件。溶血实验及蛋白吸附实验结果显示,纳米颗粒具有良好的血液相容性及稳定性,也就表明纳米颗粒可以通过静脉注射的方式给药。流式结果及荧光结果说明纳米颗粒的细胞摄取为时间及剂量依赖性。添加转铁蛋白修饰的纳米颗粒处理后,CML细胞有更高的荧光强度,表明转铁蛋白修饰增强了纳米颗粒对CML细胞的靶向性。共聚焦显微镜结果表明,Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs首先定位于溶酶体,随时间推移逐渐释放。2.Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs作为抗体的细胞内递送载体,可以通过Trim-Away途径对CML细胞中BCR-ABL癌蛋白发挥良好的降解效果。在Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs处理后,K562及K562/G01细胞内BCR-ABL及p-BCR-ABL蛋白表达水平逐渐下降,且CML细胞增殖受抑,细胞凋亡增加。然而,Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs对于BCR-ABL阴性细胞株的增殖凋亡无显著影响。这些结果表明Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs可以靶向降解BCR-ABL癌蛋白,而对BCR-ABL阴性细胞的存活无影响。3.我们探究了蛋白酶体和TRIM21在Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs引起BCR-ABL表达降低过程中的作用。抑制蛋白酶体活性或将Trim21敲低,Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs引起的BCR-ABL蛋白的降解得到了回复,表明蛋白酶体活性及TRIM21的存在是Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs发挥BCR-ABL降解的必要条件。荧光共定位分析及Co-IP实验也显示,CML细胞经Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs处理后,BCR-ABL及TRIM21存在互作关系。表明Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs是通过Trim-Away途径发挥作用的。4.Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs处理对CML细胞在小鼠体内的致癌能力也发挥了抑制效果。Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs处理组小鼠体重、外周血白细胞计数、肝脾重量、肝脾及骨髓细胞浸润情况、CD45+细胞比例均低于对照组,而小鼠生存期明显高于对照组。此外,PLGA NPs、Tf-Cou6-PLGA NPs及Ab@Tf-Cou6-PLGA NPs表现出良好的生物相容性。外周血AST、ALT及BUN含量与对照组相比无明显差异,说明纳米颗粒对小鼠无肝肾毒性。HE染色结果也显示,与PBS组相比,纳米颗粒处理组小鼠主要脏器中无明显的炎性细胞浸润,表明纳米颗粒生物相容性良好。同时,小动物成像结果显示,经不同纳米颗粒处理后小鼠骨髓中荧光强度有明显差异。添加了转铁蛋白修饰的纳米颗粒组与无修饰纳米颗粒组相比在小鼠骨髓中具有更强的富集,表明转铁蛋白修饰提高了纳米颗粒对CML细胞的靶向性。综上,我们成功构建了包载抗BCR-ABL抗体的PLGA纳米颗粒,并实现了抗体的细胞内递送。我们的研究表明,利用纳米颗粒将抗BCR-ABL抗体靶向转运至CML细胞内可通过Trim-Away途径靶向降解BCR-ABL癌蛋白,为慢性髓细胞白血病患者,特别是TKIs耐药患者提供了一种有前景的治疗策略。