【摘 要】
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家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori Cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)质型多角体病毒属(Cypovirus)。基于近原子分辨率的冷冻电镜三维重构
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家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori Cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)质型多角体病毒属(Cypovirus)。基于近原子分辨率的冷冻电镜三维重构可知,BmCPV衣壳是对称的正20面体,衣壳具有12个顶点,由60个非对称单元组成,每个非对称单元包括核衣壳蛋白(Capsid Shell Protein,CSP)、大型凸起蛋白(Large Protrusion Protein,LPP)以及塔状凸起蛋白(Turret Protein,TP)。BmCPV无囊膜,单衣壳的特性使之成为国内外冷冻电镜单颗粒三维重构研究的模式材料。本研究以BmCPV的CSP和LPP作为目标蛋白,构建转移载体pU-CSP-HismCherry及pF-LPP-His-eGFP,将转移载体pU-CSP-His-mCherry利用Cre-Loxp位点同源重组到AcMultiBac中,同时将转移载体pF-LPP-His-eGFP通过Tn7转座位点转座至AcMultiBac中,获得Ac-rSw106-inv-CSP-His-mCherry、Ac-rSw106-inv-LPP-eGFP以及Ac-rSw106-inv-CSP-mCherry-LPP-eGFP重组菌液。使用可表达侵染蛋白的AcrSw106-inv-CSP-His-mCherry、Ac-rSw106-inv-LPP-eGFP、Ac-rSw106-inv-CSPmCherry-LPP-eGFP重组菌株侵染Sf9细胞,3 d后分别观察到樱桃红色荧光、增强型绿色荧光及两种荧光的共表达。收集上清获得重组病毒Ac-CSP-His-mCherry、Ac-LPPHis-eGFP和Ac-CSP-His-mCherry-LPP-His-eGFP,Western blot检测到目的蛋白相对分子质量所对应的条带,证明CSP和LPP在Sf9细胞中成功表达。将被重组病毒AcCSP-His-mCherry、Ac-CSP-His-mCherry-LPP-His-eGFP感染的Sf9细胞超声破碎,使用蔗糖密度梯度离心纯化分离上清,获得两种不同的VLPs,CSP-VLPs和CSP-LPPVLPs,透射电子显微镜下可见两种形态良好的VLPs。通过对CPV病毒结构蛋白的理化性质分析及同源建模,为重组蛋白表达纯化提供了理论依据及参考。同时通过生物信息学分析CPV病毒结构蛋白CSP和LPP的密码子偏爱性,发现上述两种结构蛋白适用于Sf9细胞的表达,但是密码子的使用存在一定的差异性,为后续实验提高CSP和LPP的表达量提供了密码子优化方案。通过杆状多基因表达系统表达CSP-VLPs和CSP-LPP-VLPs,为深入解析单衣壳病毒结构提供了良好的理论基础;同时构建好的CSP-LPP-VLPs可以在内部和外部搭载外源分子,可以用于基因治疗投送工具、开发新型生物农药、制备新型的纳米材料、运送RNAi干扰小分子、展示表位多肽等用途,发展前景较好。
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