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耶式解脂酵母作为产油酵母,由于其独特的生理特性以及细胞自身强大的油脂积累能力,已成为优势细胞工厂之一。为了在解脂酵母中引入异源合成路径并且调控细胞内的代谢流,大量的研究被开展,用于开发合成生物学工具实现对解脂酵母基因的有效调控。CRISPRi技术是近几年发展迅速的基因调控手段,已经被广泛应用于各种生物体中,发挥抑制目标基因表达的功能。在本研究中,我们利用五种抑制蛋白分别在解脂酵母中构建了不同的CRISPRi系统,这五种抑制蛋白分别是来自弗朗西斯氏菌的dCpf1蛋白,来自酿脓链球菌的dCas9蛋白,以及三种融合蛋白dCpf1-KRAB、dCas9-KRAB和dCas9-Mxi1。基于在解脂酵母中建立的荧光报告系统与PVA检测系统,我们验证了CRISPRi系统在解脂酵母中工作的可行性并探究了抑制效率与靶向位置之间的关系。通过设计10个gRNA靶向gfp基因的不同区域,我们发现CRISPRi系统在解脂酵母中能够实现调控基因表达的功能,PVA检测系统的结果也证实了这一点,但是这些结果也反映出一个问题:无论使用哪一种抑制蛋白,抑制效率与靶向位置之间都没有规律性的联系,即无法通过靶点位置预测抑制效率。为了在解脂酵母中实现高效快速的基因抑制,我们设计了多点抑制方案,并开发了Golden-brick assembly技术实现了多gRNA的一步组装。在两种多点CRISPRi系统中,通过分泌3个不同的gRNA同时靶向gfp基因,实现了对gfp的高效抑制,抑制效率高达85%（dCpf1多点系统）和92%（dCas9多点系统）。同时,利用多点CRISPRi系统,我们比较了两种III型启动子SNR52’-tRNAGly与SCR1’-tRNAGly对于基因抑制的能力,发现SCR1’-tRNAGly更适用于多点体系。另外,我们通过多点CRISPRi系统实现了多基因的扰动,包括同时抑制gfp和vioE两个基因,以及vioA,vioB和vioE三个基因。综合而言,我们利用五种不同的抑制蛋白成功实现了CRISPRi系统在解脂酵母中调控基因表达的功能。而且证实了通过Golden-brick assembly一步组装,多gRNA靶向策略能够实现对单个基因不同位置以及多个基因的高效转录抑制。这种简单高效的方法为解脂酵母的代谢研究、合成生物学研究以及基因功能研究提供了有效的工具。