论文部分内容阅读
孵化酶（Hatching enzyme, HE）是动物胚胎孵化过程中消化卵壳的一类蛋白酶。本课题组业已报道了一种家蚕孵化酶样基因(BmHEL)，但经原核表达的BmHEL对家蚕卵壳降解活性较弱。在硬骨鱼中，有两种孵化酶HCE和LCE相互协作共同消化卵壳。家蚕中是否存在其它孵化酶？本研究通过生物信息学方法并结合RACE技术，成功克隆了另一种家蚕孵化酶（样）基因BmHELⅡ，对之进行分子特性分析，原核表达及启动子区特性分析。这些研究结果将有助于从分子水平上进一步研究家蚕的孵化和精子发生的机制。本研究主要获得以下四部分结果：1. BmHELⅡ的克隆与分子特性分析：通过生物信息学手段并结合RACE技术，我们获得了另一种家蚕孵化酶基因的全长cDNA序列(BmHELⅡ, GenBank登录号：JN627443)。BmHELⅡ全长977bp,包含一个885bp的开放阅读框，编码294个氨基酸，包括预测的16个氨基酸的信号肽和208个氨基酸的成熟酶区。BmHELⅡ蛋白分子量为33.62kDa，等电点为5.44，含有虾红素家族的两个特征保守序列。生物信息学分析结果显示，BmHELⅡ蛋白序列与其它物种已经鉴定出的HE序列的蛋白酶功能区有29.5%~87.0%的同源性。BmHELⅡ基因为6-外显子-5-内含子结构。BmHELⅡ基因转录本相对表达量随着胚胎发育而上升并在孵化时达到顶峰，随后逐渐下降，其瞬时表达性基本与孵化酶基因相吻合。另外，BmHELⅡ基因转录本在家蚕五龄幼虫期到蚕蛾期精巢组织中，持续维持高水平表达，初步推测BmHELⅡ可能与家蚕的精子发生相关。2. BmHELⅡ的生物学功能验证：我们将BmHELⅡORF克隆至原核表达载体pET28a，转化至大肠杆菌BL21，进行表达。融合蛋白以包涵体形式存在，含有6×His-Tag序列，可通过Ni-NTA亲和层析得以纯化，纯化后的蛋白可通过Western Blot检测到。经纯化、复性的BmHELⅡ或BmHEL对家蚕卵壳具有一定的降解活性，但BmHELⅡ与BmHEL的混合物显示对卵壳具有更高活性，结果显示两者可能都参与了家蚕孵化过程。3. BmHEL与BmHELⅡ基因启动子的克隆与特性分析：分别克隆BmHEL与BmHELⅡ基因上游约1.3kb的启动子区：BmHELp、BmHELⅡp；生物信息学预测BmHELp、BmHELⅡp都含有与胚胎发育相关的转录因子结合位点：GATA-1和HSF1；BmHELp、BmHELⅡp各自含有一些特异性的结合位点，如c-Rel、Tst-1、YY1、Abd-B等。以luciferase基因为报告基因，分别构建报告质粒，转染至家蚕BmN细胞，细胞水平上测定两者都具有一定的转录活性。这为进一步筛选调控孵化酶基因表达或组织特异性的顺式作用元件提供基础信息。4.孵化率高低不一的家蚕与野蚕BmHEL基因启动子的克隆与比较分析：从中系、日系和欧系三大地理品系约500份家蚕品种中选择具有代表性的六个孵化率高低差异明显的家蚕品种及镇江野蚕品种，分别克隆启动子BmHELps、BmandHELp；多序列比对结果显示不同品种家蚕的BmHELps序列一致性高达99.3~100%，初步推测1.3kb启动子区可能不包含调控孵化率高低的直接信息。BmandHELp与BmHELps的一致性为87.5~88.0%，这主要由于野蚕BmandHELp中缺失一段81bp的序列所致。