随着社会的发展进步,人们对全身和局部的电离损伤的担心愈来愈大,这些电离损伤来源于:核电站事故、恶性肿瘤治疗性的辐射、长时间的X线透视、核医学中过量放射性材料的吸入、核爆炸性恐怖事件等。机体损伤后出现协调的愈合过程,其中包括多种细胞、细胞因子和细胞外基质之间错综复杂的网络作用。正常创面愈合是由旁分泌或自分泌的许多细胞因子或生长因子介导和调控的级联放大反应实现的。放创复合伤难愈创面的愈合过程紊乱,修复细胞数量减少或功能受损,导致对创面愈合起重要作用的生长因子合成降低,胶原合成和炎性细胞减少等。骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）促进伤口愈合的功能性特征包括:能够移行到创伤或炎症的部位,参与受损组织的再生与重建,刺激固有的祖细胞增殖和向不同方向分化,通过分泌生长因子和重新塑造细胞来促进受损细胞的恢复,发挥特殊的免疫调节和抗炎作用。有效地把BMSCs作为一种修复细胞和/或外源基因表达的载体来运用于临床是目前的一个研究热点。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的功能是作为促内皮细胞分裂剂,趋化性媒介物和血管渗透性的诱导物,它是在创伤愈合级联中唯一的起多重功能作用的因子,包括血管发生、内皮形成和胶原沉积。局部微生物的持续感染也是创面难愈或不愈的原因之一。防御素富含正电荷,作用于细胞膜,具有广谱高效的杀菌活性。由于其独特的作用机制,几乎无耐药性,其中人β防御素3（human beta defensins,hBD-3）在人类预防和治疗感染性疾病方面发挥了重要作用,其在很小剂量范围内就表现出对革兰阳性菌的抗菌活性,同时其抗菌活性是非盐离子浓度敏感性的,也不引起溶血,分子量小,合成快,弥散快,不伤害人体组织细胞,是理想的抗感染的活性抗菌肽。研究显示hBD-3的重组体和化学合成的hBD-3的抗菌性和生物学特性与分离出来的天然肽没有区别。为了研究促进放创复合伤等慢性难愈性损伤的愈合,我们构建了pVIVO1-hVEGF₁₆₅-hBD-3真核质粒载体,用于转染大鼠的BMSCs,并将hVEGF₁₆₅/hBD-3基因修饰的BMSCs移植到大鼠放创复合伤的伤口皮下,以期大量合成释放hVEGF₁₆₅和hBD-3,共同促进创面愈合。主要方法和结果如下:1.hVEGF₁₆₅/hBD-3双基因共表达真核质粒载体的构建和鉴定。利用RT-PCR方法分别从白血病细胞（HL60）和牙龈组织中扩增出hVEGF₁₆₅和hBD-3基因片段,通过DNA重组技术将基因片段先后重组于pVIVO1-mcs真核表达载体上,构建成重组质粒载体pVIVO1-hVEGF₁₆₅和pVIVO1-hVEGF₁₆₅-hBD-3,分别用酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组质粒载体进行鉴定。运用jetPEI转染试剂将重组质粒转染BMSCs后,采用RT-PCR、免疫荧光细胞化学和Western blot方法证实重组真核质粒转染BMSCs后,能成功高表达外源基因hVEGF₁₆₅和hBD-3。2.重组质粒pVIVO1-hVEGF₁₆₅-hBD-3转染BMSCs后表达产物活性鉴定。分别收集转染重组质粒pVIVO1-hVEGF₁₆₅-hBD-3（T）、转染重组质粒pVIVO1-hVEGF₁₆₅（C1）、转染空载体（C2）以及正常未转染（N）的BMSCs无血清培养上清,分别命名为T-CM,C1-CM,C2-CM和N-CM。为了检测分泌出的hVEGF₁₆₅能刺激细胞增殖和移行,另外设立了一组T-CM/Ab,即T-CM中加入hVEGF₁₆₅中和抗体,用来阻断hVEGF₁₆₅的作用效应。将生长状态良好的内皮细胞EA.hy926按4×10³ /孔接种于含有100μL /孔完全培养基的96孔板中。常规培养24小时后,每孔更换上述5种条件培养基,按CCK-8试剂盒的说明连续检测5d以观察增殖效应。结果显示:与C2-CM、N-CM和T-CM/Ab组相比,T-CM和C1-CM组在第1-4d能够显著的促进细胞增殖（p<0.05）,表明表达的外源基因hVEGF₁₆₅有促进细胞增殖的作用。将内皮细胞EA.hy926接种于12孔板,待其达到95%的融合时,用一无菌的1mL移液头,在培养板孔中央垂直交叉划出一个“十”,使单层细胞形成划痕,再用PBS冲洗2次,之后再每孔中加入1 mL上述5种条件培养基。划痕后0、4、8、12和18 h时用倒置显微镜于“十”两侧固定区域摄像。运用图像分析处理软件测量愈合率。结果显示T-CM和C1-CM组在划痕后第4、8、12和18h的愈合率明显高于C2-CM、N-CM和T-CM/Ab组（p<0.05）,表明表达的外源基因hVEGF₁₆₅有促进细胞迁移的作用。对上述四种培养上清进行冷冻干燥、重溶,获取20倍浓缩液,然后采用K-B纸片法观察其对大肠埃希菌（EC, ATCC25922）、绿脓杆菌（PA ,ATCC27853）、金黄色葡萄球菌（SA,ATCC25923）、枯草芽孢杆菌（BS,ATCC62037）和白色念珠菌（真菌,CA, ATCC10231）的抗菌效应。结果显示,T组培养上清浓缩液出现显著抑菌环,其它组没有抑菌环。表明重组质粒转染BMSCs后,表达的外源基因hBD-3有抑制细菌和真菌的作用。3.重组质粒pVIVO1-hVEGF₁₆₅-hBD-3转染BMSCs后局部移植对放创复合伤创面修复的影响。复制大鼠放创复合伤全层皮肤缺损创面,以局部点状注射移植转染重组质粒pVIVO1-hVEGF₁₆₅-hBD-3的BMSCs为T组,以注射移植转染重组质粒pVIVO1-hVEGF₁₆₅的BMSCs为C组,以注射移植正常未转染的BMSCs为N组,以注射PBS为S组。在移植后1d、3d、7d、13d和20d,大体观察创面愈合情况,同时测定残留面积和愈合时间。各时相点分别取材,石蜡切片经HE染色,观察各组各时相点创面的病理形态变化;石蜡切片经Sirius red染色后,偏振光显微镜下观察胶原纤维含量的变化;免疫组织化学染色观察外源基因hVEGF₁₆₅/hBD-3和创面肉芽组织内层粘连蛋白（Laminin）的表达情况。结果显示,大体观察,在各时相点,与C、N、S组比较,T组创面感染程度较轻,愈合速度较快,创面平均愈合时间为20d,而C、N、S组的平均愈合时间是22-23、24-25和27-28d。移植术后7d、13d和20d时,T组中剩余残留面积百分比显著低于其它3组（P<0.05）;HE染色结果证实T组有更好的肉芽组织形成;胶原纤维Sirius red染色结果表明,T组胶原纤维含量和厚度明显高于其它3组;创面免疫组织化学观察到,T组中外源基因hVEGF₁₆₅/hBD-3大量表达,而且创面肉芽组织内反映血管基底膜形成的Laminin表达呈强阳性。T组与C组的差异可以推测:hBD-3在创伤愈合中也许发挥了一定的作用,也许与hBD-3的抗微生物的活性有关。C组与N组的差异可以推测:hVEGF₁₆₅固有的促内皮细胞增殖和血管发生的特性也许在创伤愈合过程中发挥了一定的作用。局部移植双基因修饰后的BMSCs确实能促进创伤愈合,这也许缘于分泌促内皮细胞增殖、血管发生的hVEGF₁₆₅和抗微生物的hBD-3,才导致了创面处更好的肉芽组织的形成/成熟、皮肤附件的重塑和更低的感染率。这些数据证实,把这种干细胞疗法和基因疗法联合运用于难愈创面是很有潜力的。