肿瘤是人类健康的头号杀手,也是人类疾病研究领域的重要课题。虽然有多种多样的因素导致肿瘤,但通常肿瘤的发生都伴随着癌基因的激活和抑癌基因的失活。然而,由于癌基因诱导的细胞衰老（Oncogene induced cellular senescence,OIS）这一天然抗肿瘤屏障的存在,单个癌基因的激活或抑癌基因的失活并不总是会导致肿瘤产生,而OIS在动物肿瘤模型和人类肿瘤患者的癌前病变中经常被发现,但在晚期癌症中基本不存在,表明恶性肿瘤细胞中存在着逃逸OIS的机制。因此,研究肿瘤细胞逃逸衰老的机制以及癌基因的激活和抑癌基因突变之间的协同作用十分有必要。许多原癌基因都被证实能够诱导OIS,如Ras,Raf,Myc等,其中原癌基因Ras是人类癌症中最易突变的癌基因之一。有大约33%的人类肿瘤中存在着Ras的激活突变。激活后的Ras基因主要通过Ras-Raf-MEK-ERK信号途径,上调两种关键的衰老诱导因子p19ARF和p16INK4A的表达,从而引起p53和Rb的激活触发OIS。在本实验室之前研究中发现,第五代的WS（WRN早老综合症）小鼠胚胎成纤维细胞在体外培养的过程中,很快便进入衰老,但其中一部分细胞可以逃离衰老并永生化,进而可以在SCID小鼠体内形成肿瘤,在这些肿瘤的细胞中我们发现同一个p53突变,即p53N236S（在人类中为p53N239S,以下简称p53S）。对p53S基因敲入小鼠的研究发现:p53S突变蛋白不但丧失了野生型p53调控细胞周期和细胞凋亡的功能,而且通过功能获得的形式具有了癌基因的潜能,提示p53S可能是细胞逃逸衰老继而肿瘤化过程的关键。我们的研究显示,在p53N236S杂合子(以下简称p53S/+)小鼠MEF细胞中转染H-RasG12V后,细胞会进入OIS的状态,在衰老状态持续一段时间后（约十代后,以下简称晚期细胞）,细胞会逃逸衰老,并且将这些逃逸衰老的细胞注射到SCID小鼠体内后可以形成肿瘤。为了了解这些细胞逃逸OIS的机制,首先,我们通过免疫荧光检测野生型p53和p53S在细胞中的定位,发现在衰老的细胞中（以下简称早期细胞）野生型p53集中于核内,而p53S主要在胞质中表达。而在晚期细胞中,p53S与野生型p53的定位与早期细胞相反。WB的结果显示在晚期细胞中p53的总蛋白水平上升,而p21的水平并未增加,提示晚期细胞中入核的p53S调控了与野生型p53不同的下游通路。随后,通过Ch IP-on-chip芯片扫描结果的差异基因网络互作分析,我们发现,PGC-1α（peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1α）在p53S背景细胞中被显著调控,并且我们也发现在晚期细胞PGC-1α表达上调。进一步的Ch IP实验表明,p53S蛋白能够结合到PGC-1α的启动子上,提示PGC-1α是受p53S调控的下游因子。之后,我们又通过免疫荧光检测PGC-1α的定位,发现晚期细胞核中PGC-1α表达上升,说明PGC-1α可能转录调控其下游基因。而PGC-1α主要调控线粒体的合成和抗氧化酶的表达,且衰老的细胞通常ROS水平较高。因此,我们首先检测了早晚期细胞的ROS水平,在晚期细胞中ROS显著下降,通过Real-time PCR,我们发现晚期细胞抗氧化酶m RNA水平上调,提示PGC-1α可能通过在晚期细胞中提高抗氧化酶的表达降低ROS的水平。随后我们又检测了线粒体的质量与数量,发现晚期细胞不论是线粒体膜电位、ATP和线粒体数量都显著高于早期衰老细胞。有研究报道,在细胞中过表达H-RasG12V后,ROS水平上升,细胞自噬增强。因此,我们检测了自噬相关蛋白的表达,发现在早期细胞中不论是LC3-II,还是Atg-5、Atg-7、Atg-12表达均上调,并且通过Lyso Tracker?Red DND-99染色也发现早期细胞自噬显著上升。提示在p53S杂合的细胞背景下,PGC-1α在晚期逃逸衰老的细胞中能够通过降低ROS水平,间接抑制细胞自噬,从而增加线粒体数量。之后,我们又通过对逃逸衰老的晚期细胞进行加H2O2刺激,使其ROS上升,我们发现其自噬水平增加,细胞周期阻滞,说明ROS诱导了自噬的上调,以及早期细胞的提前衰老。而线粒体数量以及质量的提升可以使细胞线粒体活性增强,氧化磷酸化上升,ATP产量增加,提高细胞的能量代谢水平,使细胞活力恢复,重新启动细胞周期,有利于细胞逃逸癌基因诱导的生长阻滞。综上所述,本研究表明p53S是通过上调PGC-1α的表达,增强抗氧化酶的表达,降低ROS,减弱细胞自噬,提高线粒体的质量与数量,从而逃逸H-RasG12V诱导的细胞衰老。本研究的意义在于在p53S突变杂合子细胞的背景下,初步探明了细胞逃逸H-RasG12V诱导的OIS继而肿瘤化的机制,进一步的理解了细胞恶性转化的分子机制,并为该类型肿瘤的治疗提供了新的思路和靶点。