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Doublesex和mab-3相关转录因子7(double sex and mab3- relatated transcrip- tion factor7,Dmrt7)在动物体内可表达Dmrt7蛋白。该蛋白是哺乳动物生殖系统的重要蛋白,主要含有DM结构域,其主要生物学功能是调控精子发生、控制性别的分化。应用Dmrt7蛋白在治疗雄性动物产弱精、不产精等方面具有丰富的使用价值和广阔的前景。然而,由于天然Dmrt7蛋白来源稀少,不能满足临床和科学研究的需要,因此利用转基因技术生产Dmrt7蛋白已经逐渐成为研究的热点。本研究首先从小鼠睾丸组织中分离提取得到总RNA,利用RT-PCR法得到Dmrt7基因全长cDNA序列。对Dmrt7基因序列进行PCR扩增后,分别进行重组腺病毒载体和重组腺相关病毒载体的构建及鉴定。获得的实验结果如下:(1)用一对预先设计好的引物,采用RT-PCR法,从小鼠睾丸组织总RNA中扩增出的产物,经1.0%的琼脂糖凝胶电泳,结果显示,在1100bp处有一条阳性目的条带。对所扩增的cDNA进行测序,结果显示与Genebank中所记载的序列一致,未发生碱基突变。(2)细菌内同源重组法构建Dmrt7重组腺病毒载体。穿梭载体pShuttle -Dmrt7-IRES-GFP质粒经酶切鉴定正确后,用PacⅠ酶线性化,与pAdEasy-l共转染大肠杆菌BJ5183进行同源重组,获得pAd-Dmrt7重组腺病毒阳性克隆质粒,经PacⅠ酶切,通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,得2.9kbp特异性小片段,获得正确的重组腺病毒载体Ad-Dmrt7。(3)将重组Ad-Dnrt7转染293细胞,24h后可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光,收集病毒上清,进行PCR鉴定及病毒滴度测定,鉴定结果显示,在1100bp处有一明显条带;采用半数荧光细胞法测定重组腺病毒滴度为0.95×10~8PFU/ml。(4)细胞内同源重组法构建Dmrt7重组腺相关病毒载体。将测序正确的Dmrt7基因亚克隆至pAAV-MCS中,酶切鉴定获得的重组pAAV-Dmrt7质粒,纯化后与pRC质粒以及pHelper质粒共转染HEK 293细胞,包装获得重组Dmrt7腺相关病毒。转染24h后可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光。重组Dmrt7腺相关病毒经酶切,PCR鉴定病毒上清,在1100bp处出现一明显条带。采用半数荧光细胞法测定重组腺相关病毒滴度为1.5×10~9PFU/ml。